异丙肾上腺素预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

赵 慧，王 雄，魏晓倩



异丙肾上腺素预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

赵 慧，王 雄，魏晓倩

目的 探讨异丙肾上腺素预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激的影响，阐述相关保护机制。方法 将32只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、异丙肾上腺素预处理组(ISO组)和选择性β2肾上腺素能受体拮抗剂ICI118551+ISO-I/R组(ICI组)，每组8只。通过结扎左冠状动脉前降支(LAD)30 min再灌注2 h建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。用苏木素伊红染色法观察大鼠心肌组织形态，蛋白印记法测定磷酸化丝/苏氨酸激酶(P-Akt)的表达水平，原位末端标记法及免疫组化法分别检测心肌细胞凋亡率及心肌凋亡相关蛋白Caspase-3的表达，黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)浓度。结果 与I/R组比较，ISO组大鼠心肌损伤程度明显减轻，P-Akt的表达明显增多、心肌细胞凋亡率减低、Caspase-3表达减低、血清SOD活性增高、MDA浓度减低，差异有统计学意义(P<0.05)；ICI118551可阻断ISO的作用，与ISO组相比，ICI组大鼠心肌损伤程度重，P-Akt的表达明显减少、心肌细胞凋亡率增高、Caspase-3表达增高、血清SOD活性减低、MDA浓度增高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 异丙肾上腺素对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与激动β2肾上腺素能受体，启动PI3K-Akt信号通路相关。

心肌缺血再灌注损伤；异丙肾上腺素；肾上腺素受体；PI3K-Akt信号通路

随着冠脉介入术在急性冠脉综合征领域的推广应用，心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reper fusion injury，MIRI)成为心肌血运重建术相关研究的焦点。近年来，有研究表明：异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)对大鼠MIRI有显著的保护作用[1]，但具体机制鲜有报道。ISO作为儿茶酚胺类经典药物，可同时作用于β1肾上腺素受体(β1-adrenergic recepter，β1-AR)和β2肾上腺素受体(β2-adrenergic recepter，β2-AR)[2]。β1-AR和β2-AR是参与心脏功能活动最重要的肾上腺素能受体，生理情况下交感神经激动主要经β1-AR受体介导；在心力衰竭等病理条件下则更依赖β2-AR受体参与心功能调节[3-4]。本研究通过建立大鼠心肌MIRI模型，观察ISO对大鼠MIRI的影响，并初步探讨β2-AR及磷脂酰肌醇3激酶-丝/苏氨酸激酶(phosphateidylinositol 3 kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt)信号通路在其中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 成年雄性SD大鼠32只，体重(225±20)g，由中国食品药品检定研究院提供。异丙肾上腺素及选择性β2肾上腺素能受体拮抗剂ICI118551购自美国Sigma公司。蛋白印记(Western blot)用兔抗鼠磷酸化丝/苏氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase，P-Akt)单克隆抗体(美国abcam公司)，β-actin抗体(bioswamp公司)。原位末端标记(TUNEL)试剂盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成公司。

1.2 动物模型的建立 SD大鼠称重后，20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，以针形电极置于四肢皮下，记录Ⅱ导联心电图，气管插管，连接呼吸机。沿胸骨左缘3～4肋间开口，暴露心脏，于左心耳根部下方2 cm处肺动脉圆锥旁以6-0无创缝合线结扎左冠状动脉前降支，用套管夹闭法阻断其血流。血管结扎成功标准：心电图ST-T抬高(≥0.15 mV)，放松后ST-T回落50%以上。

1.3 实验分组及干预 用随机数字法将32只雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、异丙肾上腺素预处理组(ISO组)和选择性β2肾上腺素能受体拮抗剂ICI118551+ISO-I/R组(ICI组)，每组8只。Sham组只穿线不结扎，麻醉150 min；I/R组缺血30 min，再灌注2 h；ISO组制备心肌缺血再灌注模型1 h前腹腔注射ISO 10 mg/kg；ICI组腹腔注射ICI118551 0.5 mg/kg，30 min后腹腔注射ISO 10 mg/kg，1 h后制备心肌缺血再灌注模型。Sham组和I/R组均腹腔注射相同体积的生理盐水。

1.4 心肌组织病理 取心肌组织于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，脱蜡后，苏木素伊红(HE)染色，脱水封片，光学显微镜下观察。

1.5 Western blot法检测P-Akt的表达 将左心室缺血区心肌组织于裂解液中提取组织蛋白，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清。采用BCA法测定蛋白浓度，每孔10 μg蛋白并加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min，离心后上样。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转仪将电泳分离后的蛋白转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，兔抗鼠P-Akt单克隆抗体4 ℃孵育过夜。次日用HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2 h，增强化学发光法(ECL)显影。采用凝胶成像系统(UVP)行灰度值分析，以目的条带灰度值/β-actin条带灰度值反映P-Akt表达情况。

1.6 TUNEL法检测凋亡心肌细胞 取缺血区心肌组织，10%中性福尔马林4 h以上，石蜡包埋，切片。按TUNEL试剂盒要求检测细胞凋亡，经DAB显色、苏木素轻度复染后，光学显微镜下观察，凋亡细胞的细胞核呈深浅不一的棕黄色，每张切片在400高倍镜下随机取10个视野，计数凋亡细胞数即凋亡指数(apoptosis index，AI)。AI=(凋亡心肌细胞数/所有心肌细胞数)×100%。

1.7 免疫组织化学法测定 Caspase-3凋亡蛋白表达水平 取左心室心肌组织，石蜡切片，按试剂盒说明书SABC法染色，一抗为磷酸缓冲盐溶液(PBS)1∶60稀释的Caspase-3抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色。在400倍光镜下观察，细胞浆呈棕黄色为Caspase-3蛋白阳性表达，采用BI-200图像分析系统测量平均光密度值(A值)。

1.8 SOD活性和MDA浓度的测定 于再灌注2 h，经腹主动脉抽取动脉血，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，硫代巴比妥酸法检测MDA浓度。将动脉血离心后，取血清-20 ℃保存。严格按照试剂盒说明书步骤，用分光光度计检测A值，据公式计算SOD活性、MDA浓度。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理形态的检测结果 Sham组大鼠心肌纤维排列整齐，结构清楚，细胞无水肿，间质未见异常。I/R组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱，间质水肿。与I/R组相比，ISO组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱程度较轻，间质未见明显异常。与ISO组比较，ICI组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱程度加重，部分可见坏死，间质水肿、增宽，可见炎性细胞浸润。详见图1。

Sham组 I/R组 ISO组 ICI组图1 各组大鼠心肌组织病理学形态变化的苏木素伊红染色结果(×400)

2.2 各组大鼠心肌组织中P-Akt表达情况 与Sham组相比，I/R组大鼠心肌组织中P-Akt明显增多(P<0.05)。与I/R组比较，ISO组大鼠心肌组织中P-Akt表达明显增多(P<0.05)。与ISO组相比，ICI组P-Akt表达明显降低(P<0.05)。详见图2、图3。

注：1为Sham组；2为I/R组；3为ISO组；4为ICI组。

注：a为Sham组；b为I/R组；c为ISO组；d为ICI组;与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，**P<0.05；与ISO组比较，△P<0.05。

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡率的检测结果 与Sham组相比，I/R组大鼠心肌细胞凋亡明显增多(P<0.05)。与I/R组相比，ISO组大鼠心肌细胞凋亡明显减少(P<0.05)。与ISO组相比，ICI组心肌细胞凋亡明显增多(P<0.05)。详见图4。

Sham组 I/R组 ISO组 ICI组

2.4 各组大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白的表达 与Sham组相比，I/R组大鼠心肌细胞Caspase-3表达水平明显升高(P<0.05)。与I/R组相比，ISO组大鼠心肌细胞Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05)，与ISO组相比，ICI组Caspase-3表达水平明显升高(P<0.05)。详见图5、表1。

Sham组 I/R组 ISO组 ICI组

2.5 各组大鼠血清SOD活性和MDA浓度的测定 与Sham组相比，I/R组大鼠血清SOD活性降低、MDA浓度升高(P<0.05)；与I/R组相比，ISO组大鼠血清SOD活性升高、MDA浓度降低(P<0.05)；与ISO组相比，ICI组血清SOD活性降低，MDA浓度升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

组别nSOD(U/mL)MDA(mmol/L)Sham组8269.82±3.91 2.48±0.19I/R组8190.07±3.631)8.04±0.201)ISO组8230.72±2.392)4.65±0.162)ICI组8160.22±2.503)12.00±0.183) 与Sham组比较,1)P<0.05;与I/R组比较,2)P<0.05;与ISO组比较,3)P<0.05。

3 讨 论

目前，关于ISO对缺血再灌注心肌作用的具体机制仍存在较大争议。国内有研究证明预处理方式腹腔注射ISO 10 mg/kg可对抗大鼠MIRI；国外学者Tong等[5]在大鼠离体实验中证实ISO 在10 nmol/L浓度下可诱发如缺血预处理样的心脏保护作用，缩小心肌梗死面积。然而，Tang等[6]发现皮下注射ISO 2.5 mg/(kg· d)持续7 d可通过氧化应激、增加Cx43蛋白表达等诱导心肌病理性肥厚，加重MIRI，因此在基础研究中常被用作诱导心肌损伤模型。

本实验以10 mg/kg剂量给大鼠腹腔注射ISO 1 h后，再制备大鼠MIRI模型，结扎前降支动脉30 min，再灌注2 h。通过比较阻断β2-AR前后发现，与应用高选择性β2-AR拮抗剂ICI118551相比，ISO组的心肌组织形态较规整，心肌细胞凋亡及氧化应激相关指标明显优于ICI组(P<0.05)。这提示激活β2-AR可使缺血再灌注心肌细胞获益。既往有关β-AR与MIRI的大量研究表明：β-AR激活既可介导心肌保护作用，也可引发心肌损伤。其中，β1-AR通过激活蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)，抑制细胞色素-C氧化酶活性，加重再灌注期心肌梗死损伤[7]；而β2-AR则通过PI3K/AKT/eNOS/NO途径[8]对抗MIRI。这与本实验结果相一致。

本实验中通过测定P-Akt的表达水平、心肌细胞凋亡率及Caspase-3蛋白的表达发现，分别与I/R组、ICI组比较，ISO组P-Akt的表达水平增高至2～3倍，心肌细胞凋亡率及Caspase-3蛋白的表达明显减低(P<0.05)。从而证明，ISO可能通过激活PI3K-Akt通路，抑制心肌凋亡，进而对MIRI产生保护作用。这与最新研究硫化氢后处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤产生保护作用的机制相类似[9]。PI3K-Akt通路作为再灌注损伤挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信号系统最为重要的信号通路之一[10]，其最显著的作用是调节细胞凋亡过程。该信号通路下游的Caspase家族，被视为凋亡信号传导的共有途径，是一组含半胱氨酸的天冬氨酸特异性水解酶。其中，Caspase-3是该家族细胞凋亡的终末执行因子。可在多种细胞因子调节下，激活核内核酸酶，裂解DNA片段及细胞蛋白，从而触发凋亡[11-13]。

此外，本研究发现，与I/R组相比，ISO组的SOD活性明显增高，MDA浓度减低；与ICI组比较，ISO组的氧化应激水平更为显著地减低(P<0.05)。这提示ISO可通过激活β2-AR抑制氧化应激，以对抗大鼠MIRI。近年来，人们发现氧化应激损伤[14-15]是MIRI发生发展过程中的重要环节。SOD作为防御氧自由基损伤的第一道屏障，能够催化还原氧自由基，生成H2O2[16]。在过氧化氢酶的作用下进一步还原成对人体无害的水和氧[17]。MDA即膜脂质过氧化的产物，可反映心肌细胞氧化应激的损伤程度。

综上所述，ISO可有效保护MIRI，其可能机制是通过兴奋β2-AR，进一步激活PI3K-Akt途径，以抑制凋亡和对抗氧化应激。但由于ISO在应用过程中存在致心律失常、心肌损伤[18-19]等不良反应，针对PI3K-Akt途径上游及下游分子机制探讨尚待深入，ISO临床应用于MIRI治疗仍需大量的理论依据及实践经验。

[1] 王继春，胡笑容，谢菁，等.异丙肾上腺素对大鼠心肌缺血再灌注损伤中高迁移率族蛋白1表达的影响及机制[J].中华老年心脑血管病杂志，2014，3(16)：302-306.

[2] Ma X，Song Y，Chen C，et al.Distinct actions of intermittent and sustained β adrenoceptor stimulation on cardiac remodeling[J].Sci China Life Sci，2011，54(6)：493-501.

[3] Forleo C，Sorrentino S，Guida P，et al.Beta1 and beta2-adrenergic receptor polymorphisms affect susceptibility to idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Cardiovasc Med (Hagerstown)，2007，8：589-595.

[4] Gordeladze JO，Jynge I，Borchgrevink PC，et al.Enhanced responsiveness of the myocardial beta-adrenoceptor-adenylate cyclase system in the perfused rat heart[J].Biosci Rep，1998，18：229-250.

[5] Tong H，Bernstein D，Murphy E，et al.The role of beta-adrenergic receptor signaling in cardioprotection[J].FASEB J，2005，19(8)： 983-985.

[6] Tang Y，Wang M，Le X，et al.Antioxidant and cardioprotective effects of Danshensu on isoproterenol-induced myocardial hypertrophy in rats[J].Phytomedicine，2011，18(12)：1024-1030.

[7] Spear JF，Parbu SK，Galati D，et al.Beta1-adrenergic activation contributes to ischemia-reperfusion damage as well as playing a role in ischemia preconditioning[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2007，292(5)：H2459-H2466.

[8] Bhushan S，Kondo K，Predmore BL，et al.Selective beta 2-adrenergic simulation attenuates myocardial cell death and preserves cardialfunction after ischemia reperfusion injury[J].Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology，2012，32(8)：1865-1874.

[9] 胡明珠，周波，盛琼，等.PI3K-Akt信号通路及β2-AR蛋白在外源性硫化氢后处理减轻大鼠离体心肌缺血再灌注损伤中的作用[J].中国药理学通报，2016，32(2)：268-273.

[10] 王雨晴，吴艳娜，李欣，等.RISK信号通路在1-磷酸鞘氨醇后适应减轻心肌缺氧/复氧损伤中的作用[J].中国药理学通报，2015，31(2)：181-185.

[11] Yang B，Ye D，Wang Y.Caspase-3 as a therapeutic target for heart failure[J].Expert Opin Ther Targets，2013，17：255-263.

[12] 秦玉凤，钱磊，李天鹏，等.兔心肌缺血再灌注时对其交界区细胞凋亡的影响及意义[J].实用医药杂志，2013，30(6)：522-524.

[13] Parrish AB，Freel CD，Kornbluth S.Celluler mechanisms controlling caspase activation and function[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2013，5：a008672.

[14] Lin LF，Qin Q，Qian ZH，et al.Protective effects of melatonin on ischemia-reperfusion induced myocardial damage and hemodynamic recovery in rats[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18：3681-3686.

[15] Guler L，Bozkirli F，Bedirli N，et al.Comparision of the effects of dexmedetomidine vs.Ketamine in cardiac ischemia/reperfusion injury in rats-preliminary study[J].Adv Clin Exp Med，2014，23：683-689.

[16] Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-supperoxide dismutase：the first vival structure of a typical cellular copper chaperone-independent hyperstable dimeric enzyme[J].J Virol，2015，89(1)：824-832.

[17] Yoon G，Park S.Antioxidant action of soy isoflavones on oxidative stress and antioxidant enzyme activities in exercises rats[J].Nutr Res Pract，2014，8(6)：618-624.

[18] Liu T，Shi SB，Qin M，et al.Effects of dantrolene treatment on ventricular electrophysiology and arrhythmogenesis in rats with chronic beta-adrenergic receptor activaion[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther，2015，20(4)：414-427.

[19] Garg M，Khanna D.Exploration of pharmacological intervention to prevent isoproterenol-induced myocardial infarction in experimental models[J].Ther Adv Cardiovasc Dis，2014，8(4)：155-169.

(本文编辑郭怀印)

山西医科大学第一医院(太原 030001)

王雄，E-mail：sxwangxiong@163.com

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.010

1672-1349(2017)01-0036-05

2016-08-21)

引用信息：赵慧，王雄，魏晓倩.异丙肾上腺素预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(1)：36-40.