地黄饮子汤对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的影响

2017-02-11刘季红

中西医结合心脑血管病杂志 2017年2期

刘季红

刘季红

目的探讨脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的实验观察。方法选取清洁级大鼠60只，随机分为尼莫地平组、地黄组、模型组、对照组，各15只。给予大鼠双侧颈总动脉夹闭，制造大鼠脑缺血再灌注的模型，分别测定脑组织内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。尼莫地平组：造模后每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg；地黄组：造模后每日灌服地黄饮子汤36 g/kg；模型组：造模后每日胃灌盐水1次；对照组：正常饮食。连续喂药3周后进行Morris水迷宫实验测试大鼠的学习记忆能力，病理组织观察计算大鼠脑梗死面积。结果模型组与对照组比较，SOD含量明显降低、MDA含量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，证明实验造模成功。模型组学习记忆能力潜伏期、跳台实验潜伏期与对照组比较均明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；尼莫地平组和地黄组学习记忆能力潜伏期、跳台实验潜伏期分别与模型组比较均明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。地黄组脑梗死面积明显小于尼莫地平组，差异有统计学意义(P<0.05)。尼莫地平组和地黄组分别与模型组比较，SOD含量明显增高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论地黄饮子汤可修复脑缺血再灌注后神经损伤，提高学习记忆能力，为临床治疗提供实验依据。

脑缺血再灌注；大鼠；学习记忆能力；超氧化物歧化酶；丙二醛

脑缺血再灌注导致脑细胞损伤进一步加重，目前脑缺血再灌注已成为我国心脑血管疾病的第一大死亡原因。急性脑缺血导致大脑神经受损，神经功能缺失[1-2]，神经生长因子受抑制，严重者导致残疾和死亡。临床上以中药为主要的治疗药物，地黄饮子汤[3-4]在临床上治疗缺血性中风、血管性痴呆、阿尔茨海默病、脑萎缩等有一定疗效。本实验通过建立脑缺血再灌注大鼠模型，研究地黄饮子汤对大鼠学习能力、记忆能力的影响及对脑组织的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组健康清洁级Wistar大鼠60只，雌雄不限，成年体重250 g～280 g，由中国医科大学动物部提供，动物合格证号：SCXK-LN2014-0008。随机分为尼莫地平组、地黄组、模型组、对照组，各15只。尼莫地平组：造模后每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg，连续3周(天津中央药业公司生产，生产批号：20130067，规格：20 mg/片，与注射用水溶解)；地黄组：造模后每日灌服地黄饮子汤36 g/kg，连续3周；模型组：造模后每日生理盐水灌胃1次，连续灌胃3周；对照组：正常饮食。连续喂药3周。

1.2 研究方法

1.2.1 造模选用10%水合氯醛麻醉尼莫地平组、地黄组、模型组3组大鼠，固定，颈部正中切开，分离双侧颈总动脉并用动脉夹钳夹30 min，用温盐水纱布保护切口创面，松开动脉夹30 min后，再次用动脉夹钳夹30 min，使大鼠处于脑缺血再灌注状态，模型完成。

1.2.2 实验指标最后一次脑灌注后每组随机取出1只大鼠断头，取除大脑烘干称重，加入9倍盐水制成10%脑组织匀浆液，参照试剂盒说明书加入超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和考马斯亮蓝蛋白，测定脑组织内SOD和MDA蛋白含量。

1.3 药物配制参照《黄帝素问宣明论方》里地黄饮子的配制方法：熟地黄12 g，山茱萸15 g，石斛15 g，巴戟天15 g，白茯苓12 g，山茱萸15 g，石斛15 g，炮附子15 g，麦门冬15 g，肉苁蓉15 g，菖蒲12 g，远志10 g，官桂10 g，五味子10 g。分别用12倍和10倍量水煎煮2次，各1 h，将两次药液混合，用旋转仪蒸发浓缩，干燥密封备用。

1.4 仪器中国医科大学实验动物中心提供Morris水迷宫实验记录仪，OLYMPUS光学显微镜。

1.5 Morris水迷宫实验：

1.5.1 定位航行实验用于测试所有大鼠的学习能力和记忆能力。实验共4 d，每天3次，每次1 min。训练场地由一圆形水池和移动平台组成，水池上方有摄像机和监视器与电脑连接，记录大鼠游行轨迹、路程、到达平台时间(潜伏期)。实验前将池中注入清水和牛奶，使水池变成不透明颜色，水温保持24 ℃，水池分为四个象限，在密室内进行实验。在实验前1 d将大鼠放入水池中适应环境2 min。次日进行实验，大鼠在池中1 min内若未能找到平台，潜伏期为60 s；在平台上休息60 min后再次进行训练。每只大鼠训练3次，连续训练4 d，分别记录每组大鼠潜伏期。

1.5.2 跳台实验用于检测大鼠刺激后回避反应时间(潜伏期)。经过定位航行实验后，将大鼠放于平台适应环境5 min，开始通电，观察大鼠是否双足同时跳上绝缘台，每只大鼠训练3 min。24 h后通过电脑开始测试每只大鼠在3 min内跳上绝缘台的次数和时间(潜伏期)。

1.6 测量大鼠脑梗死面积治疗3周后，断头取脑，盐水冲洗大脑并吸干，大脑冠状切片，加入1%2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)磷酸液染色，避光30 min，间隔6 min转动1次，将脑片放在电镜图像分析系统中，计算脑梗死面积。

2 结果

2.1 4组大鼠学习和记忆能力比较模型组的错误次数、潜伏期与对照组比较均明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。尼莫地平组和地黄组的错误次数、潜伏期与模型组比较均明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

组别n 学习能力错误次数(次)潜伏期(s) 记忆能力错误次数(次)潜伏期(s)尼莫地平组152.95±1.312)78.78±18.572)2.34±0.592)114.24±22.952)地黄组152.79±1.132)75.96±20.832)2.08±0.632)117.64±21.792)模型组155.35±1.761)98.36±23.921)2.85±0.781)92.73±18.121)对照组152.29±1.08 68.93±14.86 1.74±0.58 126.57±24.86 与对照组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05。

2.2 4组大鼠跳台实验潜伏期比较模型组潜伏期比对照组明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；地黄组和尼莫地平组潜伏期均比模型组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.3 4组大鼠脑梗死面积比较对照组脑梗死面积为0。地黄饮子组和尼莫地平组脑梗死面积明显小于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。地黄组脑梗死面积明显小于尼莫地平组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 4组大鼠脑梗死面积比较 %

2.4 4组大鼠SOD和MDA含量比较模型组与对照组比较，SOD含量明显降低、MDA含量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，证明本实验造模成功。治疗后地黄组和尼莫地平组与模型组比较，SOD含量明显增高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

组别nSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)尼莫地平组15130.26±18.741)2)3.26±1.791)2)地黄组15136.15±21.231)2)3.52±1.681)2)模型组1591.86±19.251)6.58±2.211) 对照组15157.79±23.64 2.33±1.58 与对照组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05。

2.5 4组大鼠TTC染色(见图1)

地黄组尼莫地平组模型组对照组

3 讨论

脑缺血再灌注损伤病理机制复杂，如脑内发生过氧化反应、细胞膜通透性增加、细胞水肿、细胞酸中毒、能量代谢障碍、自由基生成过多，细胞炎性因子释放，凋亡等。SOD是一种金属蛋白酶，它能清除由过氧化反应生成的氧自由基，清除氧自由基同时，SOD含量减少[5]。MDA是由氧自由基与不饱和脂肪酸发生氧化反应的产物，即MDA含量提示脑组织内氧自由基的含量。因此本实验模型组SOD含量降低，MDA含量增高，证实造模成功。通过分组治疗，测试4组大鼠Morris水迷宫实验中学习记忆能力潜伏期和跳台实验潜伏期，得出结论地黄组和尼莫地平组潜伏期均明显缩短；通过脑梗死面积比较，地黄饮子汤疗效明显优于尼莫地平。治疗后，地黄组和尼莫地平组均使脑组织内SOD含量增高，MDA含量降低。

地黄饮子汤具有驱毒化瘀、滋肾阴、补肾阳的功效，促进脑神经功能恢复。地黄饮子汤通过降低脑细胞的过氧化反应，增加神经细胞内SOD含量，增强机体清除过多的氧自由基能力，改善细胞膜通透性，维持细胞正常功能[6-7]，同时地黄饮子汤能改善脑部能量代谢，降低脑中乙酰胆碱酯酶活性，减轻海马神经元损伤[8-10]，进而改善脑供血不足大鼠的学习记忆能力。研究发现[11-12]地黄饮子汤可显著提高脑组织氧化应激能力，通过不同剂量地黄饮子临床研究得出，高剂量地黄饮子明显提高大鼠脑内SOD活性，减少细胞凋亡和氧化损伤，延缓大脑老化，保护脑细胞。

综上所述，地黄饮子汤可修复脑缺血再灌注造成的神经损伤，进而提高学习记忆能力，为临床治疗脑缺血再灌注提供实验依据。

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