mTOR抑制剂对大鼠肝癌生长抑制作用的研究

蔡靓羽，张建楠，尹卫娟，徐敏逸，赵劲风

（1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏无锡214071；2.中南大学湘雅医院卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南长沙410008）

论著

mTOR抑制剂对大鼠肝癌生长抑制作用的研究

蔡靓羽1，张建楠1，尹卫娟2，徐敏逸2，赵劲风2

（1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏无锡214071；2.中南大学湘雅医院卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南长沙410008）

目的探讨mTOR抑制剂对大鼠肝癌的抑制作用及其机制。方法将肝癌细胞植入同源大鼠的肝脏，然后用mTOR抑制剂西罗莫司治疗4周。用磁共振成像监测肿瘤生长情况，通过微脉管密度和血管铸型等体内实验及细胞增殖、微管形成及主动脉环化分析等体外实验评估西罗莫司抗血管生成和抑癌效果。结果西罗莫司治疗组大鼠与对照组相比生存时间明显延长、肿瘤体积小、肝细胞转移和腹水少。西罗莫司还降低了瘤内微血管密度并导致肿瘤广泛性坏死。内皮细胞增殖被抑制所需的西罗莫司浓度低于肝癌细胞。mTOR抑制剂明显抑制微管形成及动脉环的血管发芽新生。西罗莫司治疗的肿瘤中血管生成减少，反而出现套叠式血管生成。结论mTOR抑制剂抑制了肝癌细胞生长，并主要通过抗血管生成作用延长了荷瘤大鼠生存期。mTOR抑制剂具有治疗肝癌的潜能。

肝癌；西罗莫司；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

肝癌是世界范围内第5大常见癌症，是导致死亡的第3大癌症[1]。肝切除和肝移植仍然是目前肝癌治疗的最有效手段，但是仅适用于肝癌早期患者。肝癌系统性化疗的效果并不理想，而化疗栓塞术等局部治疗措施对提高患者生存期作用有限[2]。因此，开发肝癌治疗的新方法和新手段具有十分重要的意义。

肝癌是富血供肿瘤，肝癌切除术后肿瘤内微管脉密度（microvessel density，MVD）可作为是肝癌患者无病生存率预测因子[3]。前瞻性研究发现肝癌患者血清血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高血清含量与肿瘤包膜缺失、肿瘤侵袭和术后复发密切相关，VEGF是内皮细胞最重要的生长促进因子[4-5]。

JO等[4]研究表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的药理学抑制剂西罗莫司能够通过抗血管生成机制抑制肿瘤生长。西罗莫司能够抑制内皮细胞中VEGF分泌和阻断VEGF信号通路。mTOR是高度保守的丝氨酸苏氨酸激酶，并在调节细胞生长和增殖过程中起重要作用。为应答细胞营养状况变化和激活其上游PI3k/Akt通路，mTOR通过磷酸化下游靶蛋白磷酸化核糖体S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase，P70-S6K）和翻译启动因子4E-结合蛋白1（4E-binding protein 1，4E-BP1），增强mRNA转录和蛋白质翻译。mTOR抑制剂诱导细胞停留在G1期，并阻断PI3K/Akt介导的增殖信号通路向下游传导[6]。免疫抑制剂西罗莫司、西罗莫司脂化物（CCI-779）和依维莫司是mTOR抑制剂，并具有抗恶性肿瘤增生和抗血管生成能力[7]。目前这些药物已用于治疗多种肿瘤的临床试验[8-9]。本研究肝癌模型中研究了mTOR抑制剂西罗莫司对肝癌增殖和血管生长的影响，以探讨西罗莫司在肝癌治疗中的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 肿瘤移植及西罗莫司治疗

ACI大鼠皮下注射MH肝癌细胞株5×106个，MH肝癌细胞株的来源即为ACI鼠，2周后ACI大鼠皮下形成肿瘤。无菌条件下剥离皮下瘤块，并剪成1 mm×1 mm×1 mm左右大小，实验组大鼠肝脏内各植入1块。肿瘤植入5 d后，开始使用西罗莫司治疗。接受治疗大鼠单个分笼喂养，根据大鼠体重，每天在食用水中加入浓度为2 mg/kg的西罗莫司，对照组大鼠食用水中不加西罗莫司。记录每只大鼠每天的摄入水量及西罗莫司剂量，2 mg/kg的西罗莫司持续喂养大鼠4周，大鼠植入肿瘤33 d后将其引颈处死，对每只大鼠进行生存评价。收集大鼠血清、全血、肿瘤组织和肝脏。肿瘤体积采用公式：V=4/3× p×r1×r2×r3计算。

1.2 肿瘤生长、坏死及微血管密度检测

肿瘤植入17 d后进行低场磁共振成像，此后每周进行1次低场磁共振检测检测肿瘤生长情况。

高效液相色谱法测量大鼠全血中西罗莫司含量。肿瘤中心坏死，其特点是宏观划分的坏死区周围可行的肿瘤组织，通过削减肿瘤最大直径半，测量宏观可见中央坏死区域最大直径和相应的垂直直径（x，y），评估肿瘤中心坏死。大鼠肝脏瘤内微脉管密度按文献描述方法进行测量[10]。

1.3 Western blot

取适量（400 mg）肿瘤组织样品，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。用Bradford法行总蛋白定量。调整每个泳道上样量为20μg左右。聚丙烯酰胺凝胶电泳：采用5％积层胶和10％分离胶;积层胶电泳电压为60V，分离胶电泳电压为120 V，总计电泳时间为2 h左右。将蛋白质转移至硝酸纤维膜：制作电转三明治，硝酸纤维膜位于阳极侧，凝胶位于阴极侧;采用30 V电压，电转12 h。将转有蛋白条带的膜常规封闭、洗膜后与兔抗人磷酸化4E-BP1抗体4℃孵育过夜，洗膜后加入羊抗兔IgG/HRP 37℃孵育4 h。洗膜后ECL显色。用Bio-Rad图像分析系统照相，用Quantity One软件分析，以相应蛋白条带的灰度值/β-actin蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。

1.4 毛细血管形成分析

大鼠大动脉内皮细胞分离后，接种于用基质胶（Matrigel）覆盖的Lab-Tek腔室培养玻片，加入西罗莫司脂化物（可溶性西罗莫司前体物质）干预细胞，72 h后固定内皮细胞，并用Diff-Quick染色，并用Scion image软件在40倍的显微镜下分析血管长度。

将体重为180～230 g，周龄为8～12周的ACI大鼠胸部主动脉分离，并切成1 mm长宽的小块。血管置于基质胶（Matrigel）覆盖的Lab-Tek腔室培养玻片内，并用含10％胎牛血清的F12-K培养基继续培养，用西罗莫司脂化物处理培养血管，对照组加入完全培养基。5 d后，固定血管，并用Diff-Quick染色。

将20μl西罗莫司脂化物溶液（终浓度0.1～1 000 ng/ml）加至脱壳的小鸡绒毛尿囊膜。24 h后，在血管中注射0.1 ml的2.5％荧光素异硫氰酸葡聚糖，并检测绒毛尿囊膜。在荧光显微镜下观察血管形态，并用CCD摄像头监测微管脉类型。

1.5 胸腺嘧啶脱氧核苷掺入实验

在2uCi/ml[3H]胸腺嘧啶核苷条件，用浓度为1～1 000 ng/ml的西罗莫司脂化物干预细胞20 h。移去培养基后，细胞用预冷5％三氯乙酸冲洗，然后用0.4 mol氢氧化钠NaOH震荡溶解细胞。通过闪烁计数测量掺入的放射量。每个实验平行3组独立3次。1.6流式细胞术期及实时定量qRT-PCR

西罗莫司脂化物溶液（终浓度为0.1～1 000 ng/ml）干预培养6 h后，收集MH细胞和内皮细胞并加入Annexin V-FITC和碘化丙啶。流式细胞仪检测Annexin V阳性量和碘化丙啶阴性量，分析细胞凋亡情况。

提取肿瘤组织中的总RNA，并在随机核苷酸混合液中用MMLV反转录酶反转录。设计并合成特异性正反向引物和荧光探针，在开始定量检测之前优化反应浓度和扩增条件。用18S核糖体RNA作为内参定量分析miRNA表达水平。Δ（Ct）表示达到相同荧光强度所需的PCR循环数量。

1.7 血管铸型

正如先前预测的，肝脏脉管系统用新鲜配制的Mercox溶液灌注，其中每5 ml树脂中含有0.1 ml的催化剂。灌注1 h后，切除肿瘤，并转移到15％的氢氧化钾溶液中浸泡。3～4周后，冲洗铸型，酒精中脱水，真空干燥器干燥。样本在金上平铺为10钠米作用，扫描电子显微镜下检测。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，多组比较采用方差分析，两组比较采用t检验，在方差分析有意义的基础上，采用LSD-t检验或SNK-q检验进行两两比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

图1 西罗莫司在体内对肝癌生长的影响

2 结果

2.1 西罗莫司对肿瘤体积和大鼠生存期的影响

磁共振成像结果表明西罗莫司处理组大鼠肿瘤体积明显小于对照组大鼠，西罗莫司处理4周后，大鼠处死前，西罗莫司处理组和对照组肿瘤体积分别是（681±142）mm3和（1 643±594）mm3，两组间差异有统计学意义（t=7.642，P=0.001）。西罗莫司处理组大鼠的评价生存期为51.5 d，高于对照组的37.0 d，两组间差异有统计学意义（t=2.289，P=0.002）。见图1。

2.2 西罗莫司对荷瘤大鼠肿瘤组织坏死和微血管密度的影响

中央坏死组织观察结果显示，西罗莫司处理大鼠癌细胞肿瘤平均直径（7.1±0.3）mm＜对照组（8.6±1.5）mm（t=1.126，P=0.036），而中央坏死组织面积（224±77）mm3＞对照组（149±144）mm3（t= 1.374，P=0.038），中央坏死组织是衡量抗血管生长效果的重要参数。此外本研究还发现有25％的对照组大鼠在实验结束时血性腹水症状，而在西罗莫司处理组则没发现。免疫组织化学结果西罗莫司处理大鼠微血管密度（MVD）低于对照组大鼠。见图2。

2.3 西罗莫司处理对4E-BP1磷酸化的影响

大鼠处死当天，血液中西罗莫司的平均含量为0.7 ng/ml。蛋白质免疫印迹实验结果表明西罗莫处理组肿瘤细胞中mTOR底物4E-BP1磷酸化程度低于对照组大鼠。见图3。

2.4 西罗莫司处理对血管形成分析的影响

实时定量PCR结果表明西罗莫司处理组大鼠肿瘤组织中VEGF miRNA的相对表达量为（9.59± 0.35）（n=10），而对照组大鼠肿瘤组织中VEGF miRNA的相对表达量为（8.73±1.21）（n=10），两组间差异有统计学意义（t=0.947，P=0.041）。

图2 西罗莫司处理对大鼠肿瘤组织微血管密度的影响

体外实验主要采用亲水性西罗莫司，亲水性西罗莫司是酯前体药物，能够迅速代谢为西罗莫司。血管形成分析结果表明西罗莫司浓度高于1 ng/ml即可抑制内皮细胞增殖。此外，高于1 ng/ml浓度的西罗莫司还可抑制主动脉环毛细血管出芽生长，主动脉环毛细血管出芽生长过程包括内皮细胞、成纤维细胞及血管平滑肌细胞增殖和迁移。浓度高于1 ng/ml发芽的毛细血管从主动脉环，包括扩散和迁移的平滑肌细胞和成纤维细胞除了内皮细胞，也被抑制在temsirolimus浓度≥1 ng/ml。鸡胚绒毛膜尿囊膜实验结果证实西罗莫司处理使血管长度下降和出芽点数量减少。见图4。

2.5 西罗莫司处理对胸腺嘧啶核苷掺入和凋亡的影响

胸腺嘧啶核苷掺入实验表明，西罗莫司处理能以剂量依赖的方式抑制内皮细胞增殖，当浓度为1 ng/ml时，西罗莫司就可以有效抑制内皮细胞增殖，而只有浓度达到1 000 ng/ml时，西罗莫司才可抑制MH肝癌细胞增殖（见表1）。其他肝癌细胞株中也得到类似结果（HepG2，Hep3B和Huh7）（见表2）。1 000 ng/ml西罗莫司处理对内皮细胞和肝癌细胞的凋亡率没有影响。

2.6 西罗莫司处理对血管铸型的影响

本研究采用血管铸型扫描电子显微镜肿观察肿瘤内脉管系，结果发现西罗莫司处理组大鼠肿瘤组织内脉管系统通畅性低于对照组（见图5A、B），结果提示西罗莫司处理组大鼠新血管形成模式和对照组存在差异，对照组大鼠毛细管丛主要通过出芽方式扩增（见图5C），而西罗莫司处理组大鼠毛细管丛以套叠方式扩增（见图5D）。

图3 西罗莫司处理对4E-BP1磷酸化的影响

图4 西罗莫司处理对血管形成分析的影响

图5 西罗莫司处理对血管铸型的影响

表1 西罗莫司处理对MH肝癌细胞和内皮细胞胸腺嘧啶核苷掺入的比较（ng/ml，±s）

表1 西罗莫司处理对MH肝癌细胞和内皮细胞胸腺嘧啶核苷掺入的比较（ng/ml，±s）

项目基线对照组浓度1101001 000 MH肝癌细胞22.3±1.8100.4±8.9114.7±9.296.4±6.287.3±4.559.2±12.7内皮细胞1.2±0.2100.6±5.752.8±5.357.9±3.639.2±1.722.7±9.5

表2 西罗莫司处理对肝癌细胞和内皮细胞胸腺嘧啶核苷掺入的影响（ng/ml±s）

表2 西罗莫司处理对肝癌细胞和内皮细胞胸腺嘧啶核苷掺入的影响（ng/ml±s）

项目对照浓度1101001 000 HepG2100.1±11.6 93.9±2.795.8±6.197.2±4.356.4±10.8 Hep3B100.5±10.8 92.8±3.894.9±3.299.2±1.662.7±8.2 Huh7100.3±9.294.6±4.995.8±6.498.5±2.171.4±7.9

3 讨论

本研究结果表明，mTOR抑制剂可阻碍肝癌进展和提高患者生存期。本研究在肝癌细胞同源大鼠中构建肝癌模型，并采用西罗莫司干预，探讨其对肝癌发生发展的影响。结果发现西罗莫司处理组大鼠较对照组肿瘤组织增长缓慢，转移和血性腹水减少。组织学检查表面西罗莫司处理组大鼠瘤内微血管密度下降，组织中央坏死面积增大。本研究结果提示mTOR抑制剂主要通过抑制内皮细胞增殖，阻碍肿瘤血管生成而抑制肿瘤生长，而mTOR抑制剂本身并不能抑制恶性肿瘤细胞增殖。

mTOR抑制剂抑制肿瘤血管生成的可能机制有：增强内皮细胞凋亡敏感性[10]、在肿瘤血管床形成血栓[11]及抑制内皮祖细胞分化等[12]。在本研究中未观察到细胞凋亡和血栓形成，本研究结果提示其最可能的机制是抑制内皮细胞增殖和芽生式血管生成。细胞增殖实验表明，MH肝癌细胞mTOR抑制剂抵抗性强于内皮细胞，当西罗莫司浓度低于1 000 ng/ml时，西罗莫司对肝癌细胞无明显抑制增殖作用，这一结果也在其他类型肝癌细胞株中得到证实。此外，同样浓度的西罗莫司可以影响主动脉环血管芽出生长和内皮细胞形成毛细血管，而主动脉环血管芽出生长涉及血管平滑肌细胞及其周围毛细血管内皮细胞形成毛细血管则只与内皮细胞相关。鸡胚绒毛膜尿囊膜实验发现0.1 ng/ml西罗莫司处理就能使血管长度下降和出芽点数量减少。这些实验结果提示mTOR抑制剂除了抑制内皮细胞曾，还能影响血管平滑肌细胞和其周围毛细血管等血管壁支持细胞。

血管出芽生长方式是在原有血管床上形成新血管的经典生长方式，血管出芽生长主要依赖内皮细胞增殖及出芽后的管腔形成。本研究采用扫描电镜观察发现，西罗莫司处理组大鼠肿瘤组织血管出芽生长被抑制，这与在内皮细胞中的研究结果一致。西罗莫司处理组大鼠肿瘤组织血管主要以套叠的方式生成。与血管出芽生长方式不同的是，血管套叠生长更少依赖内皮细胞增殖，主要通过毛细血管形成重建微血管系统完成。血管套叠生长会导致原血管腔被分割形成新血管。血管套叠和出芽生长同时存在于肿瘤组织中。

西罗莫司剂量是最大程度抑制肿瘤血管生成的关键性因素。研究表明稳定维持低浓度西罗莫司能够达到最好抗血管新生效果，而不是间歇性单次注射[13]。本研究将大鼠体内西罗莫司血清含量维持在1 ng/ml左右的水平，这一浓度移植术后免疫抑制的用量。然而，处理组大鼠微血管密度并没有明显下降，但是4e bp1磷酸化程度和VEGF miRNA表达水平下降，结果提示1 ng/ml左右的西罗莫司即可在体内激活VEGF。磷酸化mTOR底物通过损伤VEGF，HIF和Myc等编码基因miRNA转录子的翻译过程，干扰重要的致瘤信号通路。西罗莫司处理组大鼠腹水减少及VEGF miRNA表达下降正是肿瘤转移减少的重要原因。

西罗莫司处理延长了荷肝癌大鼠生存期，但不能治愈肝癌。血管铸型实验结果表明血管生成并未完全被抑制，而且还出现了套叠生长，这提示该生长方式可能较少依赖mTOR，并有助于肿瘤”逃避”抗血管新生治疗。因此可以合理推测，与细胞毒性药物联合使用可以使mTOR抑制剂取得更好的抑癌效果。

总之，本研究结果表明mTOR抑制剂能够阻碍肿瘤血管生成，诱导血管重建及使肝癌生长受损。

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（张西倩 编辑）

Inhibition of growth of hepatocellular carcinoma in mice by mTOR inhibitor

Liang-yu Cai1,Jian-nan Zhang1,Wei-juan Yin2,Min-yi Xu2,Jin-feng Zhao2
(1.The Affiliated Wuxi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Wuxi,Jiangsu 214071,China;2.Key Laboratory of Nano-biotechnology of Chinese Ministry of Health,Xiangya Hospital,Central South University, Changsha,Hunan 410008,China)

ObjectiveTo investigate the antitumoral effect of mTOR inhibitor on a HCC model.MethodsHepatoma cells were implanted into livers of syngeneic rats.The rats were treated with the mTOR inhibitor Sirolimus for 4 weeks.Tumor growth was monitored by MR imaging.Antiangiogenic effects were assessedin vivoby microvessel density and corrosion casts andin vivoby cell proliferation,tube formation and aortic ring assays.ResultsThe Sirolimus-treated rats had significantly longer survival time,smaller tumors,fewer extrahepatic metastases and less ascites than the controls.Sirolimus decreased intratumoral mic rovessel density resulting in extensive tumor necrosis.The Sirolimus concentration for inhibition of endothelial cell proliferation was lower than that for hepatoma cell inhibition.Microtubule formation and vascular sprouting of aortic rings were significantly impaired by mTOR inhibitor.Vascular casts revealed that Sirolimus significantly reduced vascular formation in tumors,but intussusceptive angiogenesis was observed.ConclusionsmTOR inhibitor significantly reduces HCC growth and prolongs survival time primarily via antiangiogenic effect.Inhibitors of mTOR may have potential in HCC treatment.

hepatocellular carcinoma;Sirolimus;mammalian target of Rapamycin

R735.7

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.006

1005-8982（2017）02-0036-06

2016-02-13