盆炎丸对解脲支原体感染小鼠血清IL-2、IL-4表达的影响

陈青，刘文娥，张婉妮，周意

（湖南中医药大学第一附属医院1.感染科，2.妇产科，湖南长沙410007；3.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

论著

盆炎丸对解脲支原体感染小鼠血清IL-2、IL-4表达的影响

陈青1，刘文娥2，张婉妮3，周意3

（湖南中医药大学第一附属医院1.感染科，2.妇产科，湖南长沙410007；3.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

目的研究盆炎丸对解脲支原体（UU）感染小鼠血清白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）表达的影响，探讨盆炎丸防治UU感染的部分免疫学机制。方法选取SPF级8周龄BALB/c雌性小鼠40只，随机分为空白组（8只）和造模组（32只），造模组造模成功后随机分为中药组、西药组和模型组，分别予以盆炎丸、克拉霉素和等量生理盐水灌胃，14 d后取小鼠阴道分泌物行UU培养，观察小鼠血清IL-2、IL-4表达水平。结果西药组小鼠全部转阴，清除率100％，中药组小鼠UU清除率为78％。①IL-2含量：西药组IL-2值最高，其次是中药组，模型组IL-2值最低。两两比较：与空白组比较，模型组差异无统计学意义（P＞0.05），中药组和西药组差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组与西药组比较，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。②IL-4含量：中药组IL-4值最低，其次是西药组，模型组IL-4值最高。两两比较，与空白组比较，模型组、中药组、西药组差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，中药组和西药组差异均有统计学意义（P＜0.05）；与西药组比较，中药组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论盆炎丸可促使UU感染小鼠阴道分泌物UU培养转阴，可通过升高IL-2水平、降低IL-4水平，发挥免疫调节作用。

盆炎丸;解脲支原体；BALB/c小鼠；白细胞介素2（IL-2）；白细胞介素4（IL-4）

盆炎丸为湖南中医药大学第一附属医院自制药，多用于治疗女性生殖道感染性疾病，已在临床应用30余年，临床疗效确切。为进一步探讨盆炎丸对解脲支原体感染的防治作用，本研究通过复制BALB/c小鼠解脲支原体（UU）生殖器感染模型，观察盆炎丸对UU感染BALB/C小鼠血清白细胞介素2（Interleukin 2，IL-2）、白细胞介素4（Interleukin 4，IL-4）表达的影响。现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物BALB/c雌性小鼠40只，8周龄，体重（20±2）g，SPF级。购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证编号：HNSLKJ20113382。阴道分泌物支原体培养阴性，排除既往感染。（根据预实验在造模过程中小鼠死亡率约为20％，实验多备小鼠8只）。

1.1.2 实验药物盆炎丸：120 g/瓶，丸剂，由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供，批号：（湘）卫药剂（97）05第021号。苯甲酸雌二醇注射液：4mg/ml，苏州市苏牧动物药业有限公司生产，批号：（2012）100862511。克拉霉素胶囊：规格0.25g×6粒，江苏方强制药厂有限公司生产，批号：国药准字H20083367。

1.1.3 UU3型菌株由湖南中医药大学第一附属医院微生物室提供。

1.1.4 主要试剂UU液体培养基：2 ml/支，由珠海银科生物工程有限公司生产。小鼠IL-2、IL-4 ELISA试剂盒：由上海晶天生物科技有限公司生产。

1.1.5 主要仪器37℃恒温箱、HB-100煮锅、超净工作台、低温冰箱、石蜡包埋机、石蜡切片机、生物组织摊片机、全封闭自动脱水机、电子分析天平、台式高速离心机、移液器、光学显微镜、高清晰度彩色病理分析系统、烧杯、量桶、眼科剪、镊子、组织剪、组织钳、止血钳等。

1.2 方法

1.2.1 UU感染液的制备及浓度测定UU感染液的制备：取临床分离的UU菌液0.2 ml，加入2 ml UU培养基中，置于37℃培养箱培养，当培养液颜色由黄色变为红色，且上清液无混浊，表明UU生长良好，经转种2、3次后，使其处于对数生长期阶段，其生理特征最为典型。浓度测定：将培养基分装于24孔酶标板的小孔中，每孔0.9 ml，在第1管加入被检菌液0.1 ml，混匀后从中吸取0.1 ml加至第2孔中，如此顺序作10倍递增稀释。将酶标板密封后置于37℃恒温箱中，培养24 h左右，以培养基颜色不再继续改变为最后判读结果，即以出现颜色变化的最高稀释度为颜色改变单位，并按UU结果将UU菌液稀释为105CCU/ml。

1.2.2 造模方法参考TAYLO和杨洪雁等[1-2]造模方法进行造模。40只SPF级BALB/c小鼠适应环境1周后，按随机数字表法随机分为两组：空白组8只，UU感染组32只。UU感染组皮下注射0.5 mg雌二醇，1次/周，共4次。第2次皮下注射雌激素后2 d开始阴道接种UU菌液。采用移液器和一次性枪头，暴露小鼠阴道，伸入小鼠阴道约0.5 cm，将50μl UU菌液注入阴道，1次/d，连续3 d，第7天加强接种1次；空白组接种UU液体无菌培养基。倒置小鼠5 min，待菌液被完全吸收后，放回笼内，分笼喂养。

1.2.3 造模确认在造模第21天通过一般情况观察、阴道分泌物UU培养、生殖器肉眼及镜下观确定造模是否成功，以喜蜷卧、食量少、毛发黄、竖毛、外阴红肿、溃烂、阴道分泌物增多，阴道分泌物UU培养阳性，肉眼见宫颈肥大、阴道子宫充血水肿、输卵管积水等，镜下炎症细胞浸润、间质疏松水肿、脓性渗出等为造模成功标志。造模过程中2只小鼠死亡，根据以上标准分析为UU急性感染所致。

1.2.4 分组与给药造模成功后将UU感染组剩余小鼠随机分成3组：中药组、西药组和模型组，每组9只。药物组成按照当归、赤芍、丹参、三棱、莪术、桃仁、党参、黄芪等药按照一定比例制成。灭菌，装无菌瓶中备用，每瓶100 g。将10 g盆炎丸研磨充分溶解于20 ml蒸馏水内（2∶1），用三角杯装好，置电炉上加热至溶液煮沸灭菌，沸腾即可，塞上橡皮塞，置离心机中，以2 000 r/min的速度充分搅拌，去其杂质。实验前放入培养箱内预温，实验后置冰箱保存。制备成混悬液，相当于含生药浓度为0.5 g/ml，根据需要再用蒸馏水稀释或浓缩。参考黄继汉等[3]文献计算小鼠药量，盆炎丸一般成人60 kg用量为3次/d，10 g/次，即人的用量为0.5 g/（kg·d），查换算系数为12.33，计算小鼠常用量为6.17 g/（kg·d），即0.12 g/（只·d），将药物浓度配制成0.3 g/ml，每次灌胃0.2 ml。克拉霉素胶囊一般成人60 kg用量为0.25 g/次，1次/12 h，人用量为8.33 mg/（kg·d），计算小鼠常用量为102.7 mg/（kg·d），即2 mg/（只·d），将药物浓度配制成5 mg/ml，每次灌胃0.2 ml。空白组及模型组以无菌生理盐水0.2 ml灌胃。于造模第22天开始给药，每天分2次灌胃给药，连续2周。

1.2.5 指标检测阴道分泌物UU培养：于造模第21和36天取小鼠阴道分泌物行UU培养。采用静置移液枪枪头于小鼠阴道内1 min，轻轻旋转蘸取阴道分泌物，然后将带有分泌物的枪头置于5 ml无菌试管的0.9 ml液体培养基中，充分混匀，盖好橡皮塞，置于37℃恒温箱中24～48 h，观察颜色变化，培养基由黄色变为红色，表示有UU生长。测定小鼠IL-2、IL-4含量：取小鼠心脏血液、阴道分泌物1～2 ml，室温下静置20 min，以3 000 r/min的速度4℃离心20min，将上清液转移至无菌试管中4℃冰箱内保存待测。在检测之前将样品、所有试剂放至常温，采用ELISA法测定小鼠IL-2、IL-4含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，当资料满足正态性和方差齐性时，多组组间比较用单因素方差分析（ANOVA），多重比较用LSD、Dunnett比较，组内自身前后比较用配对t检验；满足正态性但不满足方差齐性时，采用Tamhane-ST法；当资料不满足正态性和方差齐性时，采用非参数检验Wilcoxon秩和检验。计数资料用χ2检验。当P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴道UU转阴率

空白组实验前后UU阳性率均为0％，表明实验室质控条件良好，可排除实验组间干扰。模型组、中药组和西药组3组转阴率比较，差异有统计学意义（P=0.000），说明3组的转阴率不同。两两间进行比较：与模型组比较，差异有统计学意义（P中药组= 0.003，P西药组=0.000），说明中药组、西药组与模型组转阴率均升高；中药组与西药组比较，差异无统计学意义（P=0.471），说明两组在转阴率上无明显差异。见表1。

2.2 小鼠血清IL-2含量及分析结果

各组数据进行正态性检验，空白组、模型组、中药组和西药组的P值分别是0.984、0.358、0.127和0.272，均服从正态分布。各组数据进行方差齐性检验，Levene统计量=1.199，P=0.328，满足方差齐性。采用单因素方差分析，认为4组差异有统计学意义（F=6.170，P=0.328）。两两比较中空白组与模型组差异无统计学意义（P=0.645），中药组与西药组差异有统计学意义（P＜0.05），而中药组与西药组小鼠的血清IL-2值均高于空白组；与模型组比较，中药组和西药组差异均有统计学意义（P=0.003）；中药组与西药组比较，两组差异无统计学意义（P=0.961）。见表2。

2.3 小鼠血清IL-4含量及分析结果

表1 各组UU转阴率比较

表2 BALB/c小鼠血清IL-2含量（±s）

表2 BALB/c小鼠血清IL-2含量（±s）

IL-2含量空白组（n=8）30.54±2.88模型组（n=7）29.61±2.05中药组（n=9）35.85±5.01西药组（n=8）35.94±4.21组别

各组数据进行正态性检验，空白组、模型组、中药组、西药组的P值分别是0.112、0.443、0.334和0.258，均服从正态分布。各组数据进行方差齐性检验，Levene统计量=1.055，P=0.384，满足方差齐性。采用单因素方差分析，认为4组间差异有统计学意义（F=3.970，P=0.018）。两两比较中空白组比较，模型组、中药组和西药组差异均无统计学意义（P= 0.053、0.179和0.762）；与模型组比较，中药组和西药组差异均有统计学意义（P=0.002和0.028）；与西药组比较，中药组差异无统计学意义（P=0.297）。见表3。

表3 BALB/c小鼠血IL-4含量（±s）

表3 BALB/c小鼠血IL-4含量（±s）

组别IL-4含量空白组167.75±54.67模型组221.56±51.23中药组133.35±42.18西药组159.89±57.28

3 讨论

UU归属柔膜体纲支原体，是一类没有细胞壁，大小介于细菌和病毒之间的原核细胞微生物，是泌尿生殖道常见的条件致病菌。UU能紧紧黏附于易感宿主细胞膜表面受体上，该黏附细胞的特性成为支原体的致病性条件。当机体免疫力低下或黏膜受损时，支原体通过黏附于泌尿生殖道上皮细胞表面的受体上，引起细胞损伤，并出现上行性感染，导致非淋菌性尿路感染、尿路结石、前列腺炎、阴道宫颈感染及盆腔炎等多种疾病的产生，并与女性不孕、习惯性流产及胎儿宫内发育迟缓等有关[4-5]。随着临床上抗生素滥用及耐药株的产生，其治疗难度越来越大，而中医药治疗不仅可提高临床疗效、缩短疗程，还具有毒副反应少、使用安全的特点，如何采取中医药诊治UU感染并探讨中医药治疗机制已经变得刻不容缓。

盆炎丸为湖南中医药大学第一附属医院自制药，多用于治疗女性生殖道感染性疾病，已在临床应用30余年，主要由黄芪、白术、红藤、丹参及莪术组成。其中以黄芪为君，有益气固表、利水消肿、托毒排脓的作用，现代研究表明黄芪能增强机体免疫功能，且有抗炎和较广泛的抗菌作用[6]。白术为臣，能健脾益气、燥湿利水，现代研究表明白术能增强机体免疫功能，有抗应激、增强造血功能等作用[7]。丹参活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，能扩张血管，改善微循环，促进组织的修复与再生，对体外的多种细菌有抑制作用[8]；红藤清热解毒、活血通络；莪术破血祛瘀，行气止痛，共为佐药，共奏行气益气、活血化瘀，清热解毒之效。全方扶正祛邪，攻补兼施从而达到使机体气血调畅，局部经络通顺，邪去病愈的目的。在导师前期研究[9]中，盆炎丸治疗支原体感染气虚血瘀证在综合疗效总有效率方面盆炎丸与阿奇霉素相当，但在中医证候改善方面，盆炎丸疗效明显优于阿奇霉素。谈珍瑜等[10]研究表明，盆炎丸治疗耐阿奇霉素支原体感染总有效率与克拉霉素组比较差异有统计学意义，认为盆炎丸治疗支原体感染的疗效优于克拉霉素，且盆炎丸不良反应少，安全可靠，在临床应用方面有较大优势。盆炎丸作为该院内部自制药，对于治疗解脲支原体感染疗效可靠，值得临床推广应用。

正常情况下，辅助性T淋巴细胞亚群Th1-Th2处于平衡状态，Th1-Th2平衡失调并向Th1或Th2状态转化称为Th1-Th2的漂移[11]。IL-2是Th1细胞分泌的细胞因子，主要由活化的T淋巴细胞产生，能增强自然杀伤细胞和单核巨噬细胞的杀伤作用，其水平高低反映细胞免疫功能。IL-4是Th2细胞分泌的细胞因子，主要由活化的T细胞产生，能下调促炎因子的分泌，诱导人B细胞增殖、分化，促进B细胞合成并分泌免疫蛋白介导体液免疫。

盆炎丸重在益气化瘀，能够提升人体正气，增强机体免疫功能，本研究以盆炎丸为干预药物，通过观察盆炎丸对血清IL-2、IL-4表达水平的影响，探讨盆炎丸治疗UU感染的部分免疫机制。由于实验样本量有限，实验过程中部分小鼠死亡，对实验结果有一定影响。解脲支原体生存周期短，临床分离菌株转接时可能存在菌株部分死亡的现象，对实验的进展可能造成了一定的影响。本研究仅从IL-2、IL-4的关系出发，分析盆炎丸对Th1/Th2细胞平衡状态的影响，对于其具体机制的阐明过于单薄，可以此为基础，扩大样本量及观察指标，进一步从多个角度，多个环节进行深入探讨。

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（张西倩 编辑）

Effects of Penyan pills on expressions of serum IL-2 and IL-4 in mice infected byUreaplasma urealyticum

Qing Chen1,Wen-e Liu2,Wan-ni Zhang3,Yi Zhou3
(1.Department of Nosocomial Infection,2.Department of Gynaecology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital,Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China;3.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the effect of Penyan pills on the expressions of IL-2 and IL-4 in mice infected byUreaplasma urealyticum(UU),and to discuss the immune mechanism of Penyan pills.MethodsForty 8-week old female BALB/c mice in SPF level were selected,and randomly divided into two groups:the blank group with 8 mice and the model-making group with 32 mice.The model-making group was subdivided into three groups randomly: the model group,the TCM group and the Western medicine group,which were perfused respectively with saline, Penyan pills and Clarithromycin.Mouse vaginal secretions were cultured for UU after 14 days,and the expression levels of IL-2 and IL-4 were observed.ResultsThe clearance rate of the Western medicine group was 100％,while the clearance rate of the TCM group was 78％.The content of IL-2 was the highest in the Western medicine group,then the TCM group,the lowest in the model group.The IL-2 content in the Western medicine group and the TCM group was significantly different from that in the blank group and the model group(P＜0.01),while there was no significant difference in the IL-2 content between the blank group and the model group or between the Western medicine group and the TCM group(P＞0.05).The content of IL-4 was the lowest in the TCM group,then the Western medicine group,the highest in the model group.The IL-4 content in the blank group was not significantly different from that in the model group,the Western medicine group or the TCM group(P＞0.05).The IL-4 content in the model group was significantly different from that in the TCM group(P＜0.01)and the Western medicine group (P＜0.05).But there was no significant difference in the IL-4 content between the Western medicine group and the TCM group(P＞0.05).ConclusionsPenyan pills could enhance the clearance of UU and play a role in immune regulation by increasing serum IL-2 level and decreasing IL-4 level in mice.

Penyan pill;Ureaplasma urealytium;BALB/c mouse;IL-2;IL-4

R-332

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.004

1005-8982（2017）02-0026-05

2016-03-23

刘文娥，E-mail：liuwene@163.com；Tel：13517872658