蛋白激酶B（PKB/AKT1）小干扰RNA通过WNT/β-Catenin通路抑制人胃癌细胞株BGC-823的增殖与迁移*

李树静，张志成，林佳，高超，王忠利

（锦州医科大学附属一院外科，辽宁锦州121001）

论著

蛋白激酶B（PKB/AKT1）小干扰RNA通过WNT/β-Catenin通路抑制人胃癌细胞株BGC-823的增殖与迁移*

李树静，张志成，林佳，高超，王忠利

（锦州医科大学附属一院外科，辽宁锦州121001）

目的观察蛋白激酶B（PKB/AKT1）小干扰RNA（siRNA）对人胃癌细胞株BGC-823增殖与迁移的影响，探讨PKB/AKT1在胃癌发生中的可能作用机制。方法体外培养BGC-823细胞，分为空白对照组、阴性对照组和PKB/AKT1 siRNA转染组。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot法分别检测BGC-823细胞PKB/AKT1的mRNA和蛋白表达；噻唑蓝法测定细胞增殖抑制率；划痕实验测定细胞迁移。Western blot法检测β-Catenin，侵袭转移相关的上皮性钙黏附蛋白（E-Cadherin）、神经性钙黏附蛋白（N-Cadherin）和基质金属蛋白酶（MMP-9）的表达。结果与两组对照组比较，PKB/AKT1 siRNA转染组PKB/AKT1的mRNA和蛋白表达降低，并抑制BGC-823细胞的增殖和迁移，β-Catenin，N-Cadherin及MMP-9的蛋白表达下降，E-Cadherin表达增加。结论PKB/AKT1 siRNA抑制胃癌细胞株BGC-823的增殖和迁移，其机制可能与siRNA下调PKB/AKT1表达进而抑制WNT/β-Catenin信号通路有关。

蛋白激酶B；胃癌；BGC-823；WNT/β-Catenin

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，严重威胁人类身心健康，其死亡率在所有肿瘤中位居第2位。虽然在世界范围内胃癌的死亡率下降明显，但晚期胃癌疗效仍然很差，其5年生存率在20％～30％，而胃癌的复发和转移是影响其疗效的主要因素[1]。因此，深入了解胃癌生物学行为的特性，解析肿瘤的发生、发展机制，对指导临床治疗以及提高胃癌患者生存率及建立系统的胃癌诊疗体系有着重要的意义。越来越多的证据表明[2]，在胃癌的发生、发展过程中，存在多条信号系统功能的紊乱，以及多种癌基因与抑癌基因表达水平的改变。为了维持胃黏膜细胞的稳态，PI3K和WNT信号途径等一些高度保守的信号转导途径对细胞的增殖、分化、迁移以及凋亡过程进行着精确的调控[3]。PI3K和WNT信号通路在胃癌的发生发展中起着重要作用[4]，但其具体的分子生物学机制还不清楚。本研究通过在人胃癌细胞株BGC-823中特异性干扰蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT1），探讨下调PKB/AKT1的表达对人胃癌细胞株BGC-823的增殖与迁移影响，分析胃癌发生发展的可能机制，为PKB/AKT1作为治疗胃癌的一个潜在靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RPMI 1640培养液（美国Gibco公司），胎牛血清（美国PAA公司），β-Catenin（C-18）和β-actin抗体（美国Santa Cruz公司），上皮性钙黏附蛋白（E-Cadherin）、神经性钙黏附蛋白（N-Cadherin）及基质金属蛋白酶（MMP-9）抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔和兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（北京中杉金桥生物技术有限公司），噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒和增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（北京碧云天生物技术公司），AKT1 siRNA（上海吉玛公司），Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）。BB16UV二氧化碳CO2培养箱（德国Heraeus公司），实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）扩增仪（美国Eppendorf公司），Sunrise自动酶标检测仪（美国Tecan公司），凝胶自动成像仪GDS8000、水浴式电转印槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养

胃癌BGC-823细胞（购自上海细胞所）培养基为RPMI 1640，含10％胎牛血清、100 u/ml青霉素和100μg/ml的链霉素，在饱和湿度、37℃和5％CO2孵箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。当细胞处于对数生长期时，以1×105/ml浓度接种于培养瓶或培养板中。

1.3 AKT1 siRNA的合成和转染

针对人AKT1的cDNA序列（GenBank No.NM_ 005163）设计RNAi靶点序列。AKT1 siRNA1序列：5'-GUGCCAUGAUCUGUAUUUAUU-3'，AKT1siRNA2序列：5’-GCCAUGAUCUGUAUUUAAUUU-3'，AKT1 siRNA3序列：5'-CCUCCAAAUUCUUCAAUAAUU-3'，阴性对照序列：5'-CACUUACGCUGAGUACUUCUU-3'由上海吉玛公司合成。BGC-823细胞接种6孔细胞培养板中，用Lipofectamine 2000转染细胞。实验分为空白对照组、阴性对照组和AKT1 siRNA转染组。20μmol阴性对照或AKT1 siRNA转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测Akt1的mRNA表达水平

Trizol法提取各组细胞总RNA并测定RNA浓度，逆转录合成cDNA。PCR引物序列AKT1（5'-CAGG ATGTGGACCAACGTGA-3'，5'-TCTCCTCCTCCTCCT GCTTC-3'）；Gapdh（5'-ATGGTCAGTTTGCCCTCTCG-3'，5'-TGGACCGTGTACTTGCAGAC-3'）。PCR反应条件：50℃2 min；95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共循环40次。扩增结束后，样品继续从60℃缓慢加热到95℃，生成熔解曲线。应用2-ΔΔCT法计算AKT1 mRNA在siRNA转染组和未转染组的表达差异，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）为内参对照，ΔCt＝CtAKT-CtGapdh。Ct为荧光信号强度达到预定值时所需要的扩增循环数。

1.5 MTT法测定细胞增殖率

将各实验组细胞接种于96孔板中，每组6个复孔，培养48 h后，20μl MTT（5 g/L）孵育4 h。弃去培养液，加入150μl二甲基亚砜，振荡15 min，使沉淀物充分溶解。酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值，计算48 h细胞增殖率，每组实验重复3次。

1.6 划痕实验测定细胞迁移能力

将各实验组BGC-823细胞接种6孔板中，等细胞生长至汇合度达80％，用黄枪头划痕，磷酸盐缓冲溶液清洗3次，倒置显微镜观察划痕宽度并照相。

1.7 Westernblot检测AKT1、β-Catenin、ECadherin、N-Cadherin及MMP-9的蛋白表达

提取各组细胞总蛋白并测定蛋白浓度，加入5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）样品缓冲液，100℃煮沸5 min，离心后上样，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，含3％脱脂奶粉的三乙醇胺缓冲盐水溶液（pH 7.4）将滤膜室温封闭2h，滤膜再分别与AKT1、β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9抗体及β-actin（稀释比为1∶1 000）4℃温育过夜。经TBST洗涤后，HRP偶联的IgG作为二抗（稀释比为1∶5 000）室温温育2 h后洗膜，ECL发光法显色。Image J进行蛋白条带分析。

1.8 统计学方法

应用Graphpad prism 5统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多样本均数检验用方差分析，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AKT1 siRNA转染BGC-823细胞后效率验证

与空白对照组和阴性对照组比较，AKT1 siRNA3转染组抑制BGC-823细胞内源性AKT1 mRNA水平和蛋白表达。见表1和图1。

2.2 下调AKT1表达抑制BGC-823细胞体外增殖

与空白对照组（89±5.87）％和阴性对照组（87.0± 4.16）％比较，AKT1 siRNA转染组（46±3.14）％能够抑制BGC-823细胞增殖，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

2.3 下调AKT1表达抑制BGC-823细胞迁移

空白对照组和阴性对照组BGC-823细胞于12 h后开始迁移，48 h后AKT1 siRNA转染组细胞迁移的数量较对照组少，距离相对较远（见图3）。3组细胞48 h愈合率分别为（98.48±6.91）％、（97.21±5.82）％和（23.80±3.84）％，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表达水平

与空白对照组和阴性对照组比较，AKT1 siRNA转染组β-Catenin、N-Cadherin及MMP-9的蛋白表达下降，E-Cadherin表达增加（P＜0.01）。见表2和图4。

表1 BGC-823细胞转染AKT1 siRNA后AKT1蛋白表达水平（n=3，±s）

表1 BGC-823细胞转染AKT1 siRNA后AKT1蛋白表达水平（n=3，±s）

注：†与空白对照组比较，P＜0.01

组别AKT1/β-actin空白对照组0.412±0.010阴性对照组0.403±0.013 AKT1 siRNA10.251±0.012†AKT1 siRNA20.337±0.012†AKT1 siRNA30.216±0.011†

图1 BGC-823细胞转染AKT1 siRNA后AKT1 mRNA和蛋白表达水平

图2 AKT1 siRNA抑制BGC-823细胞增殖

图3 AKT1 siRNA抑制BGC-823细胞迁移（×200）

表2 BGC-823细胞转染AKT1 siRNA后β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表达水平（n=3，±s）

表2 BGC-823细胞转染AKT1 siRNA后β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表达水平（n=3，±s）

注：†与空白对照组比较，P＜0.01

组别MMP-9/β-actin空白组0.521±0.0100.142±0.0130.307±0.0120.516±0.012阴性对照组0.493±0.0230.151±0.0130.321±0.0320.508±0.013 AKT siRNA30.189±0.013†0.510±0.021†0.235±0.018†0.175±0.011†β-Catenin/β-actinE-Cadherin/β-actinN-Cadherin/β-actin

图4 BGC-823细胞转染AKT1 siRNA后β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表达

3 讨论

PKB/AKT是Ser/Thr蛋白激酶，PKB作为信号转导通路的重要调节因子，主要通过PI3K/PKB途径调节细胞代谢、细胞周期、促进细胞生长和增殖，同时还具有抗细胞凋亡作用[5]。胃癌中也存在AKT蛋白激酶的异常激活[6-7]，但AKT1活化水平改变如何导致胃癌细胞生物学行为的变化，国内外研究的还很少。本研究首先验证AKT1 siRNA降低内源性AKT1的mRNA水平和蛋白表达，筛选出有效的作用特异siRNA。MTT和划痕愈合实验表明下调AKT1表达后抑制BGC-823细胞生长和细胞迁移。研究表明，经典的WNT/β-Catenin信号转导途径是调节细胞增殖和维持稳态所必要的[8]。WNT信号通路涉及多种组成成分和调节分子的协调表达，任何组分发生异常表达都可能导致下游基因的表达变化，引起肿瘤发生[9]。PKB/AKT1是哺乳动物细胞中WNT信号通路的关键调节因子，为探讨AKT1 siRNA抑制BGC-823细胞增殖和迁移的可能机制，笔者观察WNT信号通路重要成员β-Catenin的表达。本研究中在BGC-823细胞下调AKT1后β-Catenin蛋白表达降低，说明AKT1可通过WNT信号影响β-Catenin的表达。肿瘤转移的重要步骤是肿瘤细胞外基质迁移和入侵，很大程度上依赖肿瘤细胞的重塑和对细胞外基质的改变。基质金属蛋白酶家族中的MMP-9可降解细胞外基质，破坏上皮组织的基底膜，肿瘤细胞穿过破损的基底膜发生转移进而参与肿瘤侵袭[10]。本研究中AKT1 siRNA转染BGC-823细胞后MMP-9的蛋白表达较对照组下调，提示AKT1可能通过调节MMP-9蛋白的表达，促进BGC-823细胞的迁移，这与CUI等[11]人的观察结果相一致。钙黏蛋白Cadherins超家族分子是一类钙依赖型的细胞黏附分子，E-cadherin和N-cadherin是其代表性成员。N-cadherin蛋白过表达后可诱发肿瘤细胞移动，促进肿瘤细胞迁移和侵袭，而E-cadherin的作用正好与之相反[12]。本研究中下调AKT1表达，N-cadherin蛋白表达降低，而E-cadherin表达升高，说明AKT1可能通过调节N-cadherin和E-cadherin蛋白的表达，促进BGC-823细胞的迁移。

综上所述，本文以WNT/β-Catenin信号转导通路为切入点，采用RNA干涉从细胞水平探讨PKB/ AKT在BGC-823胃癌细胞增殖、侵袭和迁移过程中的作用和可能的分子调控机制，为胃癌的临床治疗提供新的理论依据和实验基础，关于胃癌的具体发病机制还需进一步的探讨。

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（张蕾 编辑）

siRNA of PKB/AKT1 inhibits proliferation and migration of BGC-823 cells via WNT/β-catenin signaling pathway*

Shu-jing Li,Zhi-cheng Zhang,Jia Lin,Chao Gao,Zhong-li Wang
(Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou,Liaoning 121001,China)

ObjectiveTo observe the effect of double-stranded small interfering RNA(siRNA)of protein kinase B (PKB/AKT1)on gastric cancer cell line BGC-823 cell proliferation and migration,and to explore the possible underlying mechanism.MethodsBGC-823 cells were culturedin vitroand then randomly divided into blank group, negative control group and AKT1 siRNA-transfected group.AKT1 siRNA efficiency was examined through qRT-PCR and Western blot analysis.The proliferation rate of BGC-823 cells was determined through a methyl thiazolyl tetrazolium assay,and the cell migration of BGC-823 cells was examined by scratch assay.The β-catenin,ECadherin,N-Cadherin and MMP-9 protein expression levels were determined using Western blot.ResultsCompared with those of the blank and negative control groups,the expression levels of AKT1 mRNA and protein significantly decreased in the AKT1 siRNA-transfected cells.In addition,the proliferation rate and migration of BGC-823 cells were markedly decreased.The expression level of E-Cadherin increased,whereas β-catenin,N-Cadherin and MMP-9 protein levels were inhibited in the AKT1 siRNA-transfected BGC-823 cells.ConclusionssiRNA of AKT1inhibits BGC-823 cell proliferation and migration via WNT/β-catenin signaling pathway.

PKB/AKT1;gastric cancer;BGC-823 cell line;WNT/β-catenin

R581.3

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.005

1005-8982（2017）02-0031-05

2016-03-23

2014年省级大学生创新创业训练计划项目（No：201410160032）

王忠利，E-mail：wzlaily@126.com；Tel：0416-4197637