胡椒碱提取与纯化工艺的研究

邓浩，张容鹄*，窦志浩，梁振益，冯建成，蒋瑶

(1.海南省农业科学院农产品加工设计研究所，海口 571100；2.海南大学 材料与化工学院，海口 571100)

胡椒碱提取与纯化工艺的研究

邓浩1，张容鹄1*，窦志浩1，梁振益2，冯建成2，蒋瑶2

(1.海南省农业科学院农产品加工设计研究所，海口 571100；2.海南大学 材料与化工学院，海口 571100)

采用乙醇浸提法提取胡椒中的胡椒碱，通过单因素和L16(45)正交实验，确定了最佳提取工艺条件：提取温度为65 ℃，乙醇浓度为75%，料液比为1∶30，提取时间为0.5 h，提取次数为3次。通过静态和动态实验，确定了大孔树脂分离胡椒碱的最佳工艺条件：树脂种类为AB-8，上柱浸提液浓度为1.1 mg/mL，pH值为6，洗脱液为体积分数75%、pH值为5的乙醇溶液，胡椒碱纯度由浸提液的16.46%上升到69.32%。最后，通过C18层析柱对大孔树脂纯化的胡椒碱粗品进一步纯化，用90%乙醇洗脱，经HPLC测定纯化后粗品中的胡椒碱纯度上升为81.26%。

胡椒碱；提取；分离纯化；大孔树脂

胡椒(PipernigrumL.) ，始载于唐朝苏恭的《唐木草》，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒属常绿藤本植物[1，2]。胡椒原产于印度，是重要的热带香辛料作物，广泛用于医学工业和食品工业[3]。胡椒碱是胡椒中的主要活性成分，含量为5%～9%，其分子式为C17H19NO3，近年来的研究发现胡椒碱具有抑菌[4]、抗氧化[5]、降血脂[6]等生物活性，对动脉粥样硬化[7]、抑郁症[8]等疾病有一定的预防和治疗作用，更有潜力被开发为新的抗癌药物[9,10]。

目前，胡椒碱的提取方法有酸水提取法、有机溶剂萃取法、超声萃取法以及超临界萃取法等[11-14]， 但这些方法的胡椒碱提取液中常含有油脂、色素等杂质，因此还需进一步分离纯化得到高纯度的胡椒碱。本文以有机溶剂萃取法获得胡椒碱的粗提物，并先后采用大孔树脂和C18层析柱对胡椒碱进行纯化，制备高纯度的胡椒碱，确定最佳分离纯化工艺，以期为胡椒碱的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白胡椒：新鲜胡椒采自海南省琼海市东平农场；抗坏血酸、异抗坏血酸、一水合柠檬酸、无水亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠等试剂：均为国产分析纯；纤维素酶、果胶酶：广州明曜商贸有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；HHS-4S水浴锅 上海市南阳仪器有限责任公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限责任公司；CPA225D电子分析天平 德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乙醇浸提法提取胡椒碱

1.3.1.1 胡椒碱的测定

胡椒碱测定标准曲线绘制：精密称取4.25 mg胡椒碱标准品，用无水乙醇溶解并稀释成0.85，2.55，4.25，8.5，17 μg/mL的系列标准溶液，以无水乙醇作为参比，在343 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线，回归方程为A=0.1238x-0.0257，r2=0.9998，结果显示：胡椒碱浓度在0.85～17 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.3.1.2 单因素试验

准确称取1 g胡椒粉，加入有机溶剂进行震荡提取，过滤并收集滤液，在343 nm处测定萃取液的吸光度值，通过胡椒碱标准曲线计算出提取的胡椒碱质量，分别对乙醇浓度、温度、时间、料液比、提取次数5个因素进行单因素实验，以胡椒碱提取率为指标衡量提取效果。胡椒碱的得率计算公式：胡椒碱提取率=胡椒碱质量/胡椒粉质量×100%。

1.3.1.3 正交实验

根据单因素实验结果，采用L16(45)正交实验，以胡椒碱的得率为指标，选择乙醇浓度、温度、时间、料液比、提取次数做水平正交实验，实验因素和水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.3.2 大孔树脂法纯化胡椒碱

1.3.2.1 大孔树脂种类的筛选

分别称取已处理好的9种大孔树脂AB-8，NKA，NKA-2，D-151，X-5，D-101，D-280，D-4006，NKA-9各10 g于烧杯中，分别加入吸光度为A1的20 mL胡椒碱浸提液，密封避光静置吸附12 h，取出过滤，于343 nm处测定滤液的吸光度A2；将吸附实验后的大孔树脂重新置于50 mL小烧杯中，加入50%乙醇20 mL作为洗脱剂，密封避光静置解吸12 h，取出。过滤，于343 nm处测定滤液的吸光度A3，以树脂对胡椒碱的吸附率和解吸率为指标选择最佳大孔树脂种类及最佳参数，吸附率=(A1-A3)/A1×100%，解吸率=A3/(A1-A2) ×100%。

1.3.2.2 大孔树脂静态吸附-解吸参数的优化

选择1种最佳的大孔树脂，按1.3.2.1的操作方法，以吸附率为指标，考察胡椒碱浓度、pH的最佳参数；按1.3.2.1的操作方法，以解吸率为指标，考察洗脱液浓度、pH的最佳参数。

1.3.2.3 大孔树脂动态吸附-解吸参数的优化

在大孔树脂层析柱中加入20 mL经过预处理的AB-8大孔树脂，加入50 mL胡椒浸提液，用70%乙醇溶液对胡椒碱进行洗脱，每5 mL收集1次洗脱液，测定吸光度，计算出解吸率。考察洗脱液体积对动态吸附-解吸过程的影响。

1.3.3 C18层析柱纯化胡椒碱

C18层析柱经前处理后，取150 mL经大孔树脂纯化后胡椒碱浸提液，经1.5 BV的20%乙醇除杂，依次用200 mL的30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇溶液洗脱，测定洗脱液的吸光度，以解吸率为指标，得出洗脱液的最佳体积分数。将得到的胡椒碱溶液经旋转蒸发烘干，用于测定纯度。

1.3.4 胡椒碱的纯度测定方法

按照GB/T 17528-2009 规定的高效液相色谱法(HPLC)对胡椒碱的纯度进行分析和测定。

1.3.5 数据处理方法

所有实验数据取3次重复实验的平均值，采用Origin 8.5作图，采用正交助手V3.1进行正交试验设计。

2 结果与分析

2.1 乙醇浸提法提取胡椒碱

2.1.1 单因素实验

2.1.1.1 乙醇浓度对胡椒碱提取率的影响

称取1.0 g胡椒粉于50 mL小烧杯中，分别加入20 mL体积分数为30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，密封，浸提温度60 ℃，浸提时间2 h，料液比1∶20，提取次数2次，结果见图1。

图1 乙醇浓度对胡椒碱提取率的影响

由图1可知，随着乙醇浓度的增大，胡椒碱的提取率增加，在70% 以后趋于平缓。因此，选择乙醇体积分数为70% 左右为宜。

2.1.1.2 浸提温度对胡椒碱提取率的影响

称取1.0 g胡椒粉于50 mL小烧杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，分别于30，40，50，60，70，80 ℃浸提2 h，料液比1∶20，提取次数2次，结果见图2。

图2 浸提温度对胡椒碱提取率的影响

由图2可知，在30～60 ℃范围内，随着浸提温度的逐渐升高，胡椒碱的提取率逐渐增加，在60 ℃时，提取率达到最大值5.42%；此后，随着温度继续升高，胡椒碱提取率逐渐降低，可能是由于高温下胡椒碱氧化分解造成的。因此，选择浸提温度为60 ℃左右为宜。

2.1.1.3 浸提时间对胡椒碱提取率的影响

称取1.0 g胡椒粉于50 mL小烧杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，浸提温度60 ℃，分别浸提0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，料液比1∶20，提取次数2次，结果见图3。

图3 浸提时间对胡椒碱提取率的影响

由图3可知，随着浸提时间的增长，胡椒碱的提取率增加，2 h以后维持基本不变。因此，选择浸提时间为2 h左右为宜。

2.1.1.4 料液比对胡椒碱提取率的影响

称取1.0 g胡椒粉于50 mL小烧杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，浸提温度60 ℃，时间2 h，分别采用1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35的料液比提取2次，结果见图4。

图4 料液比对胡椒碱提取率的影响

由图4可知，当料液比为1∶20时，胡椒碱提取率达到最高值4.97%，当继续降低料液比时，提取率反而下降，可能是当料液比降低到一定程度时，使杂质溶解增加，增加了对胡椒碱检测的干扰，相应减少胡椒碱的提取率。因此，选择料液比为1∶20左右为宜。

2.1.1.5 提取次数对胡椒碱提取率的影响

称取1.0 g胡椒粉于50 mL小烧杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，浸提温度60 ℃，时间2 h，料液比1∶20，分别提取1，2，3，4次，结果见图5。

图5 提取次数对胡椒碱提取率的影响

由图5可知，随着提取次数的增加，胡椒碱的提取率逐渐增加，但考虑到提取成本，选择提取次数为2～3次为宜。

2.1.2 正交实验

在单因素实验的基础上，通过L16(45)正交实验进一步优化胡椒碱的提取工艺参数，结果见表2。

表2 正交实验方案及其结果

续 表

由表2可知，5个因素对胡椒碱提取效果影响次序为A>C>D>E>B，即温度>料液比>时间>乙醇体积分数>提取次数。最佳优化组合为A4B4C4D1E3，即提取温度为65 ℃，乙醇浓度为75%，料液比为1∶30，提取时间为0.5 h，提取次数为3次。

2.2 大孔树脂法纯化胡椒碱

2.2.1 大孔树脂种类的筛选

选择9种大孔树脂，以胡椒碱的吸附率为指标，筛选出对胡椒碱吸附效果最好的大孔树脂用于纯化经乙醇浸提法提取的胡椒碱粗品，结果见图6。

图6 不同大孔数脂对胡椒碱吸附率的影响

由图6可知，不同型号的大孔树脂对胡椒碱的吸附效果排序为AB-8>D-280>D-101>D-151>X-5>D-4006>NKA-9>NKA>NKA-2，因此，选择AB-8这种大孔数脂用于纯化胡椒碱。

2.2.2 大孔树脂静态吸附-解吸参数的优化

2.2.2.1 胡椒碱溶液浓度对大孔树脂吸附性能的影响

为得到上柱的胡椒碱溶液的最佳浓度，以胡椒碱静态吸附率为指标，考察不同胡椒碱浓度对吸附率的影响，结果见图7。

图7 胡椒碱浓度对吸附率的影响

当上柱液浓度为1.1 mg/mL时，大孔树脂AB-8对胡椒碱的吸附率达到最大值87.9%。此后随胡椒碱浓度的增大，吸附率呈下降趋势，可能是大孔树脂AB-8对胡椒碱在浓度为1.1 mg/mL时吸附达到饱和状态。因此，选择上柱的胡椒碱溶液浓度为1.1 mg/mL。2.2.2.2 胡椒碱溶液pH对大孔树脂吸附性能的影响

为得到上柱的胡椒碱溶液的最佳pH，以胡椒碱静态吸附率为指标，考察不同胡椒碱溶液pH对吸附率的影响，结果见图8。

图8 胡椒碱溶液pH对吸附率的影响

当胡椒碱溶液pH值为6时，大孔树脂AB-8对胡椒碱的吸附率达到最大值88.5%。当pH值大于6后，随着pH的增大，吸附率呈下降趋势，可能是由于pH增大以后，溶液中形成了一些不利于吸附的盐类物质，影响了大孔树脂的吸附效果。因此，选择上柱的胡椒碱溶液pH为6。

2.2.2.3 解吸液浓度对大孔树脂解吸性能的影响

将已经吸附好胡椒碱的AB-8树脂分别加入20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇，密封避光静置解吸12 h后收集洗脱液并测定解吸率，结果见图9。

图9 乙醇体积分数对胡椒碱解吸率的影响

随着乙醇体积分数的增加，解吸率逐渐上升，当乙醇体积分数为70%，可以解吸70%以上的胡椒碱。因此，选择解吸液浓度为70%。

2.2.2.4 解吸液pH对大孔树脂解吸性能的影响

将已经吸附好胡椒碱的AB-8树脂分别加入不同pH的70%乙醇，密封避光静置解吸12 h后收集洗脱液并测定解吸率，结果见图10。

图10 乙醇溶液pH对胡椒碱解吸率的影响

随着乙醇洗脱溶液pH的增大，大孔树脂AB-8的解吸率呈现先升高后降低的趋势；当pH为5时，其解吸率达到最大值69.8%；当pH大于5以后，随着pH的增大，解吸率呈下降趋势。因此，选择解吸液pH为5。

2.2.3 大孔树脂动态吸附-解吸参数的优化

将浓度为1.1 mg/mL，pH为6的胡椒碱溶液加入到AB-8大孔树脂层析柱上，充分吸附后经体积分数为70%，pH为5的乙醇溶液洗脱，以累计洗脱率为指标，考察洗脱液的体积对AB-8大孔树脂洗脱效果的影响，结果见图11。

当洗脱液体积大于5 BV时，胡椒碱的累积洗脱率基本维持不变，说明胡椒碱已基本洗脱完全，故收集1～5 BV的洗脱液，经旋转蒸发仪去掉有机溶剂，测得胡椒碱的纯度由粗提物的14.46%上升到69.32%。

图11 洗脱液体积对解吸效果的影响

2.3 C18层析柱纯化胡椒碱

将纯度为69.32%的胡椒碱粗提物经C18层析柱进一步纯化，以洗脱率为指标，考察洗脱液体积分数对洗脱效果的影响，结果见图12。

图12 洗脱液体积分数对洗脱率的影响

当乙醇体积分数为90%时，胡椒碱的洗脱率达到最大值75.1%。经旋转蒸发仪去掉有机溶剂，获得胡椒碱结晶。经HPLC方法鉴定，其纯度由69.32%上升为81.62%。

3 结论

采用乙醇浸提法提取胡椒中的活性成分胡椒碱，通过单因素实验和正交实验研究了乙醇浓度、温度、时间、料液比、提取次数对提取效果的影响，得到最佳提取工艺条件：提取温度为65 ℃，乙醇浓度为75%，料液比为1∶30，提取时间为0.5 h，提取次数为3次。

采用大孔树脂法纯化了胡椒提取物中的胡椒碱，通过静态和动态吸附-解吸实验优化得到了胡椒碱最佳纯化工艺条件：大孔树脂类型为AB-8，上柱的胡椒碱浓度为1.1 mg/mL， pH值6，用5倍体积分数为70%、pH值为5的乙醇溶液洗脱，得到的胡椒碱结晶纯度由16.46%上升由69.32%。

采用C18层析柱进一步纯化胡椒碱结晶，用体积分数为90%的乙醇溶液洗脱，经HPLC方法鉴定得到的胡椒碱晶体纯度从69.32%上升为81.62%。

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Research on the Extraction and Purification Technology of Piperine

DENG Hao1, ZHANG Rong-hu1*, DOU Zhi-hao1, LIANG Zhen-yi2, FENG Jian-cheng2, JIANG Yao2

(1.Institute of Processing & Design of Agro-products, Hainan Academy of Agricultural Science, Haikou 571100, China; 2.College of Materials and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 571100, China)

The piperine is extracted from pepper with ethanol extraction method, and the optimal extraction conditions are determined by single factor and L16(45) orthogonal experiments: the ethanol concentration of 75%, the extraction temperature of 65 ℃, the solid-liquid ratio of 1∶30, the extraction time of 0.5, the extraction times of 3. Based on the static and dynamic experiments, the optimal purification conditions for piperine separated by macroporous resins are obtained as follows: the type of macroporous resins of AB-8, the extract concentration of 1.1 mg/mL and the pH of 6, the eluted liquid of 75% (V/V) ethanol solution and pH of 5, the purity of piperine increases from 16.46% to 69.32%. Finally, the crude product of piperine is purified by C18column, and eluted by 90% (V/V) ethanol solution, and the purity of piperine increases to 81.26% measured by HPLC method.

piperine; extraction; separation and purification; macroporous resin

2016-07-13 *通讯作者

海南省科学事业费项目(KYYS-2013-11)

邓浩(1987-)，男，讲师，硕士，研究方向：农产品加工。

TS202.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.028

1000-9973(2017)01-0122-06