番茄酱中单氰胺检测衍生化条件的研究

赵华锋，王瑞莲，周嘉明，孙晶

(1.青岛市华测检测技术有限公司，山东 青岛 266101；2.德国海德堡大学 经济系，德国 海德堡 999035)

番茄酱中单氰胺检测衍生化条件的研究

赵华锋1，王瑞莲1，周嘉明1，孙晶2

(1.青岛市华测检测技术有限公司，山东 青岛 266101；2.德国海德堡大学 经济系，德国 海德堡 999035)

建立了柱前衍生化高效液相色谱串联质谱法检测番茄酱中单氰胺的最佳衍生化条件；在衍生化试剂丹磺酰氯浓度为10 mg/mL，反应温度为60 ℃，反应时间为1 h，缓冲体系的pH值为10.5时，衍生效果最佳，单氰胺最低检测浓度为0.00005 mg/kg，衍生产物在48 h内稳定。

单氰胺；柱前衍生；丹磺酰氯；液相色谱串联质谱

丹磺酰氯是检测一、二级氨基酸的著名衍生化试剂，生成的氨基酸衍生物可用反相液相色谱法进行测定[1]。单氰胺分子量小、极性大，无法直接进行色谱分析，单氰胺结构中含有氨基，尝试采用丹磺酰氯衍生化反应后进行液相色谱串联质谱法测定。

目前单氰胺的检测还没有国家标准和行业标准，关于单氰胺残留检测方法的报道也很少[2]。本文以丹磺酰氯作为柱前衍生化试剂，液相色谱串联质谱法作为检测手段，对番茄酱中的单氰胺进行检测。研究了丹磺酰氯作为柱前衍生试剂使用的条件：衍生试剂的浓度、衍生化反应的时间和温度及缓冲体系的pH值对衍生化反应的影响，并得到了最佳的衍生化条件，同时考察了衍生产物的稳定性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

单氰胺标准品(98%) 上海安谱科学仪器有限公司；甲醇、丙酮、甲酸 均为色谱纯；碳酸钠、碳酸氢钠、丹磺酰氯 均为优级纯；超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪 Waters I-Class液相-XEVO TQ质谱；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；CTK80离心机 湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 仪器条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；色谱柱温度：40 ℃；流动相A：0.1%甲酸/水；流动相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

电喷雾正离子(ESI+)；母离子：276.2；定量离子：156.2；定性离子：171.2；锥孔电压：32 V；定量、定性离子的碰撞能量分别为30，20 eV。

1.3 标样溶液的配制

精确称取单氰胺标准品0.01 g(精确至0.00001 g)，用水溶解并定容至10 mL，制得1000 μg/mL标样溶液，备用。使用前根据需要稀释成不同浓度的标准工作液。

1.4 样品预处理

称取10.00 g混匀的番茄酱样品于均质器钢杯中，加入30 mL甲醇，均质2 min，10 mL甲醇分2次清洗均质棒，减压抽滤，滤液转移到100 mL的容量瓶中，并用甲醇定容到100 mL，混匀，从容量瓶中准确移取5～10 mL至具塞刻度试管中，加入碳酸钠、碳酸氢钠混合溶液和丹磺酰氯丙酮溶液，混匀后在恒温水浴振荡中反应，冷却至室温，用甲醇定容到10 mL，混合均匀后用0.22 μm的有机滤膜过滤，LC-MS/MS测试。

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的确认

单氰胺和丹磺酰氯的反应方程式见图1，这一反应中起决定作用的因素有4个，分别为缓冲体系的pH值、反应温度、反应时间和丹磺酰氯浓度，考察这4个因素对衍生化反应的影响，确定出最佳的衍生化条件。

图1 单氰胺和丹磺酰氯的反应方程式

2.1.1 反应体系pH值的确定

单氰胺和丹磺酰氯的反应要在碱性条件下进行，调节碳酸钠、碳酸氢钠缓冲溶液的pH值为8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0。分别进行衍生化反应的实验，结果表明: pH值为10.5时，反应效果最好，于是确定缓冲溶液的pH值为10.5。

2.1.2 反应温度和时间的确定

分别采用反应温度为40，50，60，70 ℃进行衍生化反应，均取得了成功，但从节能省时方面考虑，故选择60 ℃反应1 h，既快速又反应完全。

2.1.3 丹磺酰氯浓度的确定

测定了丹磺酰氯浓度在1～14 mg/mL 范围内对番茄酱样品中单氰胺衍生效果的影响，每组做3个平行，取3次测定结果的平均值。单氰胺衍生物的峰面积随丹磺酰氯浓度变化的情况见图2。

图2 丹磺酰氯浓度与单氰胺衍生物生成量的关系

由图2可知，丹磺酰氯浓度为10 mg/mL时，单氰胺的衍生基本完全；大于10 mg/mL时，单氰胺衍生物的生成量基本无变化，已趋于平衡，番茄酱中含有大量的氨基酸，会竞争和丹磺酰氯反应。因此，丹磺酰氯的浓度升高到一定程度时，才能保证单氰胺的反应正常进行，最终选择丹磺酰氯的浓度为10 mg/mL。

2.2 液质条件的优化

衍生质量浓度为0.5 mg/L的单氰胺的标准溶液，衍生产物分子量为275，质谱通过针泵连续进样，采用MS Scan方式进行扫描，调节锥孔电压，得到较强的[M+H]峰母离子276.2，对选定的母离子进行子离子扫描，调节碰撞能量，得到丰度较好的2个子离子，分别为156.2和171.2，根据MRM的色谱峰形及灵敏度，确定156.2为定量离子，171.2为定性离子。采用最佳的衍生化条件进行衍生反应后单氰胺标准溶液和番茄酱样品加标的色谱图见图3和图4。

图3 0.05 mg/L单氰胺的标准溶液色谱图

图4 番茄酱中单氰胺的色谱图(添加浓度为0.05 mg/kg)

2.3 衍生产物的稳定性及最低检测浓度

2.3.1 衍生产物的稳定性

采用最佳的衍生化条件衍生0.0002 mg/L的单氰胺标准溶液，衍生后1，12，24，36，48 h分别进行测定，测定结果表明48 h内稳定。

2.3.2 衍生产物的仪器最低检测浓度

番茄酱中添加0.0002 mg/kg单氰胺的色谱图信噪比(S/N)为12，按照S/N=3计算仪器的最低检测浓度，则单氰胺在番茄酱中的最低检测浓度为0.00005 mg/kg。

3 结论

本文成功建立了柱前衍生化高效液相色谱串联质谱法检测番茄酱中单氰胺的最佳衍生化条件：衍生化试剂丹磺酰氯浓度为10 mg/mL、反应温度为60 ℃、反应时间为1 h、缓冲体系pH值为10.5时，衍生效果最佳，单氰胺最低检测浓度为0.00005 mg/kg，衍生产物在48 h内稳定。

[1]Negro A, Garbisa S, Gotte L, et al. The use of reverse-phase high-performance liquid chromatography and pre-column derivatization with dansyl chloride for quantitation of specific amino acids in collagen and elastin[J]. Analytical Biochemistry,1987,160(1):39-46.

[2]张春涛,张玲,刘维娟,等.基质固相分散-高效液相色谱法检测葡萄和土壤中的单氰胺[C].第十七届全国色谱学术报告会论文集,2009:163-164.

Study on Derivatization Condition of Cyanamide Detection in Tomato Sauce

ZHAO Hua-feng1, WANG Rui-lian1, ZHOU Jia-ming1, SUN Jing2

(1.Center Testing International (Qingdao) Co., Ltd., Qingdao 266101, China;2.Department of Economics,University of Heidelberg,Heidelberg 999035, Germany)

To establish the optimal pre-column derivatization UPLC-MS/MS method for the detection of cyanamide in tomato sauce. The most suitable derivatization conditions are determined as follows: dansyl chloride concentration is 10 mg/mL, reaction temperature is 60 ℃, reaction time is 1 h, pH of buffer system is 10.5; the limit of quantification is 0.00005 mg/kg, the derivative products are stable within 48 hours.

cyanamide; pre-column derivatization; dansyl chloride; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry

2016-07-15

赵华锋(1981-)，男，山东临沂人，工程师，硕士，研究方向：食品安全检测。

TS207.4

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.033

1000-9973(2017)01-0142-02