开导加补益针刺治疗对形觉剥夺大鼠F-VEP及神经元的影响

齐斌，周丹

为了初步观察开导加补益针刺治疗对单眼形觉剥夺性弱视大鼠的治疗作用，本实验采用闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potential,F-VEP）及尼氏染色的方法观察了其对弱视大鼠视觉电生理及视皮层神经元形态学的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物饲养、模型建立与分组

出生14 d后的清洁级健康Wistar大鼠36只（购自吉林大学实验动物中心，排除内外眼疾病），体质量28～30 g，雌雄不限，随机进行分组，每组6只，动物房内室温设置为：18～25℃，相对湿度为：40%～70%。12 h循环昼夜光照。出生14 d Wistar大鼠左右不限，进行随机单眼睑缝合手术，建立单眼形觉剥夺动物模型。大鼠眼睑缝合7 d后进行治疗针刺治疗每日1次，共针刺7 d。

分组：（1）正常对照组：健康Wistar大鼠6只，自然光线环境下饲养，不给予任何处理。（2）阴性对照组（单眼形觉剥夺组）：在确定弱视模型建立成功后不给予任何治疗。（3）阳性对照组：在大鼠眼睑缝合7 d后灌胃给予左旋多巴（20 mg/kg）。（4）开导针刺组：于大鼠太阳穴、上星穴给予针刺治疗，捻转角度大，用力重，频率快，5 s后随势将针缓缓提至皮下，静留片刻，然后出针。（5）补益针刺组：脾俞穴、肾俞穴直刺0.6 cm，手法是捻转角度小，用力轻，频率慢，留置10 min起针，用棉球按压片刻；攒竹透睛明，从攒竹穴进针后，针体向睛明方向斜刺，不捻转不提插，静留片刻，然后出针。（6）开导补益针刺组：开导穴太阳穴、上星穴针刺手法同开导针刺组。开导穴出针再进行补益穴针刺，选取的穴位及手法同补益针刺组。

大鼠单眼缝合及治疗期间有死亡情况发生，故进行结果检测时每组取5只进行各项指标检查。

1.2 大鼠闪光视觉诱发电位的检测

剪开形觉剥夺幼鼠的缝合眼，并随即将所有大鼠放置于暗室内进行适应。应用复方托吡卡胺滴眼液（美多丽）点双眼散大瞳孔，暗适应30 min。幼鼠称量体质量，用4%水合氯醛按1 ml/100 g的比例腹腔注射，使大鼠全身麻醉。将幼鼠固定在实验台上，黑色眼罩遮挡对侧眼，充分暴露检侧眼。剔除电极所置部位体表毛发。记录电极置于幼鼠双耳前缘连线中点，参考电极置于鼻部，接地电极位于尾部皮下，记录电极、参考电极和接地电极都由不锈钢针制成单眼记录[1]。幼鼠眼睛距离闪光刺激源10 cm，共测量3次，每次间隔5 min，取测量平均值。

视觉电生理系统TEC-350参数设定：放大增益20K，高通滤波 0.1 Hz，低通滤波 75 Hz，刺激频率 1 Hz，叠加次次 13次，闪光强度 3.32 nt·s，单通道检测，全视野刺激器。

观测指标：闪光视觉诱发电位P2波的振幅(μV)以及潜伏期(ms)。

1.3 石蜡包埋切片及组织染色

各组实验大鼠均进行心脏灌注固定：每组5只，共30只生后28 d的实验大鼠，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g体质量进行麻醉，开胸，剪开右心室，用灌注头穿刺至升主动脉内，快速灌注250 mL生理盐水冲洗心血管系统，待右心耳流出清亮液体后，再快速灌注预冷的固定液 （4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液，pH 7.2～7.4）250 mL，再慢灌注，灌注完成后断头，开颅，迅速取出大脑，按照《大鼠脑立体定位图谱》切取大鼠视皮层的脑组织，置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定24～48 h。

将固定好的组织样品从4℃取出，用自来水冲洗过夜，用PBS冲洗30 min，进行乙醇梯度脱水，分别用50%、70%及85%乙醇各脱水30 min，95%乙醇I（100min），95%乙醇 II（30min），100%乙醇 I（100min），100%乙醇 II（30 min）；二甲苯透明（二甲苯 I，30 min，二甲苯 II至透明），浸蜡（60 ℃烤箱，石蜡 I、II、III各60 min），OCT包埋，制成蜡块，随后将蜡块切成6 μm厚，切片分别贴在常规载玻片和多聚赖氨酸处理过的载玻片上，放于烤箱上烤片12～24 h，2张进行HE染色，2张进行尼氏染色，2张免疫组化染色处理。

1.4 尼氏染色步骤

脱蜡（二甲苯I 5 min，二甲苯II 5min）；乙醇梯度脱水（100%乙醇I 10 min，100%乙醇II 8 min，95%乙醇 5 min，90%乙醇 3 min，80%乙醇 2 min）； 蒸馏水清洗三次，每次2 min；1%焦油紫溶液染色20 min，蒸馏水清洗三次，乙醇梯度脱水（75%乙醇1 min，95%乙醇5min，100%乙醇I10min，100%乙醇I10min）；二甲苯透明 （二甲苯I、II个30 min）；中性树胶封片。显微镜下观察，照相，并对经过染色后的视野内的大鼠视皮质层神经元数量进行计数，取三次的平均值计算。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以x¯±s表示，同一指标组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用Duncan法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 各实验组大鼠形觉剥夺眼及正常眼F-VEP检测结果（n=5）

2 结果

2.1 闪光视觉诱发电位

阴性对照组P2波振幅较正常对照组明显降低（P＜0.05），潜伏期较正常对照组明显延长（P＜0.05），阳性对照组、开导针刺组、补益针刺组及开导加补益针刺组的P2波振幅、潜伏期均明显好于阴性对照组，其中开导加补益针刺组的波形指标最好，其P2波振幅及潜伏期好于阳性对照组（P＜0.05）并与正常对照组接近（P＞0.05）（表 1）。

2.2 尼氏染色结果

尼氏染色后各组大鼠视皮质神经元呈空泡状，尼氏小体呈现深蓝色，细胞核呈淡蓝色（图1）。阴性对照组视皮层神经元数量较正常组明显减少 （P＜0.05），阳性对照组视皮层神经元数量较阴性对照组明显增加 （P＜0.05）， 与正常对照组接近 （P＞0.05）；开导针刺组和补益针刺组视皮层神经元数量较阴性对照组明显增加（P＜0.05），但低于阳性对照组（P＜0.05）；而开导加补益针刺组视皮层神经元数量明显多于阴性对照组（P＜0.05），与正常对照组和阳性治疗组无明显差别 （P＞0.05）（图2）。说明开导针刺组和补益针刺组对单眼形觉剥夺弱视具有治疗作用，而开导加补益针刺组的治疗作用更明显，并与阳性药物左旋多巴效果相当。

图2 各组大鼠视皮质层神经元数量 a∶与正常组比较，P＜0.05；b∶与阴性对照组比较，P＜0.05；c∶与阳性对照组比较， P＜0.05（n=5）

图1 各组大鼠视皮质尼氏染色（光镜，×200）A：正常对照组，可见视皮质神经元大小一致，有明显的胞浆突起；B：阴性对照组，视皮质层神经元数量较正常组明显减少；C：阳性对照组，视皮质层神经元数量较阴性对照组明显增加；D：开导针刺组，E：补益针刺组，D及E组视皮质层神经元数量较阴性对照组明显增加，但低于阳性对照组；F：开导加补益组神经元数量与正常对照组和阳性对照组无明显差别

3 讨论

古代中医对弱视的论述，散见于“小儿通睛症”“能远怯近”“远视”“小儿青盲”中。其中，形觉剥夺性弱视归属于“小儿青盲”。《医宗金鉴》谓“青盲，因胎受风邪，生后瞳仁端好，黑白分明，唯视物不见”。《龙木论》曰“小儿青盲，此眼初患之时，是腹中受惊邪之气，今生后五、七岁以来便多患眼”。根据《医宗金鉴》与《龙木论》所云，先天发育不良应为胎中受邪所致。可见，本病的病因病机为：先天禀赋不足（胎中受邪的先天发育不良），元阳不足，神光发越无能或阴阳俱虚而致精血亏损，不能上荣于目。根据历代医家的认识，形觉剥夺性弱视病因病机有虚有郁，符合开导补益的治疗原则。“开导之后宜补论”源于明代傅仁宇的《审视瑶函》，傅仁宇在该篇中指出：“夫目之有血，为养目之源，充和则有发生长养之功，而目不病，少有亏滞，目病生矣。”指出血为养目之源，血亏则目失濡养，血瘀则目病，描述了血和眼的密切关系。本课题组在多年临床研究的基础上，结合儿童弱视的发病机制的特点，提出了基于“开导之后宜补论”，即采用开导补益的针刺方法治疗弱视，开导加补益组针刺取穴为双侧取穴，开导穴为太阳、上星；补益穴采用肝俞、脾俞、攒竹透晴明。对照组采用补益方法即单纯应用补益穴治疗，记录视力、视觉诱发电位的变化以及治疗时间进行疗效对比，结果显示，以“开导之后宜补论”为理论基础，针刺治疗弱视的总有效率为100%，而补益治疗组的总有效率为75%，临床研究结果证明，采用“开导之后宜补论”针刺治疗方法能够明显改善患者的视力、视觉诱发电位振幅和潜伏期，且治疗效果优于补益治疗法[2]。

有研究表明，针刺防治弱视可能与以下几方面相关：保护视网膜神经节细胞、纠正视网膜功能及改善视网膜的血液供应、增强视觉神经细胞生物电活动、调节视环境紊乱、改善视神经传导、激活视觉皮质相应区域[3]、影响神经元营养因子及其受体的合成和分泌[4]。虽然针灸治疗弱视的临床研究资料较多，并且大多显示了良好的治疗效果，但是目前针对针灸治疗弱视的作用机理还有待深入研究与探讨。

本研究采用单眼形觉剥夺诱导弱视的动物模型，研究基于“开导之后宜补论”针刺疗法治疗弱视的作用机理，并同时比较其与左旋多巴胺、开导针刺及补益针刺治疗单眼形觉剥夺弱视的效果。有研究显示，大鼠的视觉可塑性关键期是从出生后14 d睁眼开始，至出生后45 d结束[5]。故本研究采用了大鼠出生14 d后进行单眼睑缝合手术，建立了大鼠单眼形觉剥夺诱导弱视的动物模型并观察左旋多巴胺治疗弱视及开导针刺、补益针刺及开导加补益针刺治疗的作用。视觉诱发电位是大脑皮质枕叶区对视刺激发生的电反应，代表视网膜接受刺激经视路传导至枕叶皮层而引起的电位变化。本研究通过F-VEP对接受不同干预的形觉剥夺性弱视幼鼠以及正常发育幼鼠的整个视觉通路功能完整性进行了检测。结果表明，与正常组大鼠相比，阴性对照组大鼠剥夺眼F-VEP的波幅明显降低，潜伏期明显延长，而正常眼未受影响。各治疗组间进行比较，开导加补益针刺治疗组明显优于左旋多巴治疗组、开导治疗组和补益治疗组。说明开导加补益治疗对单眼形觉剥夺诱导的弱视具有显著的治疗效果，可能改善了视觉通路功能的完整性。

形态学观察是弱视研究的热点内容，故本实验采用尼氏染色观察视皮层神经元形态的改变。结果提示，开导针刺组和补益针刺组对单眼形觉剥夺弱视视皮层的形态具有一定的改善作用，而开导加补益针刺组的作用优于开导组和补益组，并与阳性药物左旋多巴的效果相当。

综上，开导针刺、补益针刺和开导加补益针刺治疗对单眼形觉剥夺性弱视大鼠F-VEP波形及神经元损伤具有明显的改善作用，但开导加补益针刺组的作用优于开导组和补益组。