3种水稻分子标记辅助育种技术的应用概况

高美凤 王晓峰 夏莲红 曹月琴 顾明飞 杨建芳（上海市闵行区农业技术服务中心 201109）

3种水稻分子标记辅助育种技术的应用概况

高美凤*王晓峰 夏莲红 曹月琴 顾明飞 杨建芳（上海市闵行区农业技术服务中心 201109）

分子标记技术已成为水稻育种的重要辅助工具并已得到迅速发展。为提高水稻育种能力，加快水稻新品种的培育与研究进程，现重点介绍3种分子标记技术的原理、优势，以及分子标记技术在水稻育种中的应用情况，如水稻遗传图谱的构建、图位克隆与基因定位、辅助育种等，并对目前水稻分子标记辅助育种存在的问题及未来发展进行了分析和探讨。

水稻；D N A分子标记技术；辅助育种

随着耕地的锐减、人口的持续增长、经济的快速发展，增加单位面积的稻米产量、用有限的土地资源满足人们生存的需要变得越来越迫切。20世纪半矮化水稻、杂交水稻的成功培育使水稻产量获得较大提升，在一定程度上缓解了粮食生产的巨大压力。但传统水稻育种是通过表型性状对优良亲本进行选择，育种效率低，选择周期长，通常一个新品种的选育需要几年的时间，阻碍了水稻新品种的培育和研究。随着分子生物技术的发展，将分子技术融入水稻育种中，通过DNA分子标记以及亚种间已知或未知的优良等位基因来直接筛选目标性状，不仅弥补了传统水稻育种的缺陷，而且给水稻育种带来了革命性的影响，已成为优良水稻品种选育的新手段。为提高水稻育种能力，加快水稻新品种的培育与研究进程，笔者重点介绍了3种分子标记技术的原理、优势，以及分子标记技术在水稻育种中的应用情况，并对目前水稻分子标记辅助育种存在的问题及未来发展进行了分析和探讨，以供同行参考借鉴。

1 DNA分子标记技术

D N A分子标记是根据基因组中D N A片段的差异来定位、追踪、观察潜在的遗传变异和个体间的差异。与形态标记、生化标记相比，DNA分子标记技术具有以下优点：（1）准确性高，表现稳定，不受环境条件和基因表达限制，无组织及发育阶段特异性。（2）以DNA突变为基础，直接反应核苷酸水平上的差异，多态性高，数量丰富，分布广泛。（3）许多DNA标记多为共显性遗传，可用以鉴别纯合体与杂合体等。

常用的DNA标记技术主要基于DNA杂交（Southern blotting）、DNA片段扩增（PCR）、限制性酶切等技术。目前DNA标记技术已在水稻遗传图谱构建、种质资源鉴定、遗传多样性分析、重要农艺性状相关基因定位、分子辅助育种等方面被广泛应用。

2 3种水稻分子标记辅助育种技术的原理

2.1 限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism：RFLP)

RFLP是应用最早、最广泛的DNA分子标记技术。它是基于DNA杂交发展起来的分子技术，通过利用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后进行Southern杂交来反映不同个体DNA酶切位点的差异和多态性。RFLP标记不受环境等影响、多为共显性，具有典型的分子标记优势。20世纪80年代首先被用于人类基因图谱的构建，随后被广泛用于构建动植物遗传图谱及重要基因的标记。如1988年，McCouch等[1]以籼稻和爪哇稻杂交F2代群体作图完成水稻第1张遗传图谱，该图谱包含了135个RFLP标记，全长1 389 cM，覆盖了水稻全基因组。虽然RFLP标记表现稳定、多为共显性，但其所需DNA量大、周期长、成本高等因素限制了其的应用。

2.2 简单重复序列（Simple Sequence Repeat：SSR）

SSR技术是一种基于PCR扩增和微卫星DNA特性的标记技术。在真核生物基因组中普遍存在着一类长度通常在200 bp以下的DNA串联重复序列，其核心为由1～6个bp组成的基本序列，核心序列重复数目的差异导致不同等位基因和个体间遗传的高度多态性，也成为SSR标记数目丰富的基础。微卫星DNA的长度呈现高度变异，但其两侧的碱基序列却高度保守，故可根据侧翼的保守序列设计引物对微卫星DNA进行PCR扩增，通过扩增产物长度的多态性来揭示不同个体或品种间的遗传差异。如Wu等[2]研究发现在水稻中富含微卫星DNA序列，平均每225 kb和480 kb出现1个GA、GT重复。SSR标记操作简便、稳定性好，多为共显性遗传，数量丰富，分布广泛，已成为理想的分子辅助标记技术。

2.3 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism：AFLP）

AFLP是将限制性酶切技术与PCR扩增相结合创新发明的一种新的检测标记技术。该技术通过酶切基因组DNA获得长度不一的DNA片段，将酶切产物接上接头，根据接头序列和酶切位点设计引物进行特异性扩增，通过电泳条带，对长度不一的扩增产物进行辨别。A F L P克服了R F L P对DNA需求量大、周期长、技术复杂的缺点，因其多态性强、稳定性高、操作简单、分辨率高，已成为目前最有效的分子标记，被广泛用于构建高密度遗传图谱。通过比较发现，水稻中存在大量AFLP标记，远高于RFLP，适用于水稻精细图谱的构建[3,4]；Xu[5]等获得2个与水稻Sub1基因紧密连锁遗传距离仅0.2 cM 的AFLP标记，并发现水稻中AFLP遗传多样性高；陈亮[6]等通过对20个水稻品系遗传多样性分析发现，AFLP标记能更好地反映品系亲缘和地理生态上的差异，更适合多样性的研究。

3 3种水稻分子标记辅助育种技术的应用情况

3.1 水稻遗传图谱的构建

遗传图谱可表明某一物种相关性状调控基因在染色体上的位置。分子标记技术是遗传图谱构建的关键工具，根据利用同目标基因紧密连锁的分子标记，可将目标基因定位于两个分子标记之间。水稻分子遗传图谱的构建为水稻后续的遗传育种奠定了基础，有利于育种材料的选择与评估。1988年McCouch[1]等完成了水稻第1张遗传图谱，随后Causse[7]等和Harushima[8]等分别构建了包含726个、2 275个RFLP标记的水稻高密度遗传图谱，遗传密度分别提高到2、0.7 cM。2000年翁清妹[9]等利用籼稻“圭630/台湾粳”的DH群体构建了包含1 7 5个R F L P标记位点的水稻连锁图谱。2002年王春明[10]等用“台中65（粳稻）/ARC10313”（籼稻）的重组近交系（F10）构建了含113个RFLP标记、分布均匀的水稻遗传图谱。2001年Mccouch[11,12]等构建了包含2 740个SSR标记的水稻遗传图谱，平均每157 kb就有1个SSR位点。目前水稻高密度遗传图谱已经包含3267个RFLP标记，已公布的水稻SSR标记已有14 000多个，已基本覆盖水稻整个基因组。

3.2 图位克隆与基因定位

水稻由于基因组小、重复序列少、分子标记丰富，已成为单子叶植物分子标记应用与研究的代表。水稻精细遗传图谱的构建为水稻抗逆性及形态生理学重要基因的定位研究提供了重要的信息，尤其对QTLs位点的研究具有重要意义。图位克隆根据覆盖目标基因的遗传图谱，通过染色体步查逐渐逼近来获取目标基因。1995年Song[13]等利用RFLP分子标记RG103首次成功定位并克隆到1个水稻抗白叶枯病基因——Xa21。Sakaguchi[14]通过图位克隆将Xa1定位于水稻4号染色体上，随后Yoshimura[15]等从水稻中分离到Xa1，并发现其编码产物为富含亮氨酸重复序列的核酸结合蛋白（NBSLRR）。Yano[16]等利用 Nipponbare/Kasalath F2代群体和850多分子标记检测到水稻抽穗期QTLs主效基因Hd1和Hd2及微效基因Hd3、Hd4和Hd5，通过RFLP将Hd1定位于6号染色体，并成功克隆了Hd1。Wang[17]等和Bryan[18]等分别成功从水稻中分离克隆到抗稻瘟基因Pib和Pi-ta。鄢宝[19]等利用重组自交系构建了含有156个SSR标记的遗传图谱，并将3个控制糙米蛋白质含量的QTLs分别定位于水稻4、6、8号染色体。目前，通过分子标记被定位的水稻重要基因已经有100多个，广亲和基因、耐胁迫基因、高产基因、口味品质相关基因等越来越多的QTLs已被研究和定位克隆。

3.3 分子标记辅助育种

分子标记在育种中的应用主要是通过与目标性状紧密连锁的分子标记，鉴定不同个体的基因型，结合表现型进行选择育种。随着大量水稻分子标记的开发，利用分子标记技术选育优质品种也取得了很大的发展。现阶段分子标记辅助育种改良的性状主要涉及一些抗性基因，通常将一个或多个QTL基因导入或聚合到一个品种中，培育出具有广谱抗性的新品种。抗白叶枯病水稻新品种的培育是分子标记在水稻育种中应用最成功的例子。1997年Huang[20]等利用分子标记技术将Xa4、Xa5、Xa13、Xa21基因进行聚合，选育出具有广谱抗白叶枯病的新品种。罗彦长[21]等将Xa21基因通过回交成功转入到光敏核不育系中，培育了稳定的抗白叶枯病、同时保持原优良性状的新不育系。朱玉君[22]等以抗稻瘟病品系为母本、抗白叶枯病品系为父本，利用分子标记技术选出4份兼具抗稻瘟病和抗白叶枯病、育性恢复力强的新恢复系。姜洁锋[23]利用分子标记辅助选择培育了一系列抗稻瘟病和抗白叶枯病性的光温敏核不育系新材料。柳武革[24]等将Pi-1、Pi-2两个抗稻瘟基因导入保持系中，并获得抗稻瘟病表现良好的新组合。近年来，分子标记在水稻数量性状的育种中也逐渐得以应用，如杨益善[25]等通过将高产QTL基因yld1.1和yld2.1导入优良恢复系中，获得的新恢复系的产量得到了明显改良；聂元元[26]等利用分子标记辅助技术对恢复系R255进行改良，获得低直链淀粉含量的改良材料。

4 展 望

DN A分子标记技术因其特有的优势，已成为作物育种的一个重要辅助工具，分子标记辅助育种提高了育种的准确性和育种效率，受到了世界各国农业组织的重视和关注，积极开展作物分子标记开发、鉴定及在育种领域的应用已成为未来各国农业发展的趋势和重点。近年来，水稻分子标记辅助育种得到了迅速发展，然而目前分子标记技术的应用主要集中在一些单基因控制的质量性状（抗病虫害基因、耐胁迫基因），对于数量性状（如产量和品质性状）的选择效果尚不能满足目前的育种要求。随着人们生活需求的提高，培育健康绿色、优质口感的稻米已成为未来育种的方向。因此，只有提高分子标记尤其是数量性状相关辅助标记的选择开发效率，突破复杂性状遗传改良的瓶颈，加快分子标记与传统杂交育种技术相结合，减少与水稻育种过程中的盲目性，提高育种效率，才能解决未来的农业需求。

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2017-04-21

*为通讯作者