鱼类标记技术研究进展及在人工增殖放流中的应用

周辉霞+甘维熊

摘要：标记-回捕放流鱼苗是评估增殖放流效果的通用方法，成功标记放流的关键在于标记技术的选择。小规模标记放流时，重点关注标记死亡率、标志保留时间等；而在大规模标记时，则在此基础上需考虑标记的劳动强度、成本等因素。对挂牌、被动整合式雷达标、耳石标及分子标的研究概况及其各自优缺点进行了综述，并介绍了大规模标记技术在国内外人工增殖放流中的应用，为不同背景情况下的放流标记技术的选择提供参考。

关键词：增殖放流；鱼类；标记技术；大规模标记

中图分类号：S931.5；S932.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1206-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.002

Advances in Fish Labeling Technology and Its Application

in Artificial Proliferation and Release

ZHOU Hui-xia1，GAN Wei-xiong2

（1.Animal Husbandry Food Stuff Bureau of Shehong County， Sichuan Province， Shehong 629200， Sichuan，China；

2.Yalong River Hydropower Development Company， Ltd.， Chengdu 610051， China）

Abstract： Marking-replenishment floating fry is a common method for assessing the effect of proliferation and release. The key to successful marker release is the choice of marker technology. Small-scale markings are focused on marker mortality， marker retention times， and so on. In addition， in the large-scale marking need to consider the marked labor intensity， cost and other factors. This paper summarizes the research and their advantages and disadvantages of listed， passive integrated radar， otolith and molecular standard， and introduces the application of large-scale marking technology in artificial proliferation and release at home and abroad， Which can provide reference for the selection of discharge marking technology under different background conditions.

Key words： proliferation and release； fish； marking technology； mass-marking

魚类人工增殖放流是主动增殖水域鱼类资源的活动，是国内外通用的养护水生生物资源，修护水域生态和促进渔业增效的有效手段[1]。近年来，中国各地政府在不同水域都组织开展了大规模的增殖放流活动，国内大中型水电站也将人工增殖放流作为保护工程河段鱼类的一种重要措施。对放流鱼类进行标记，可跟踪其在野外环境的扩散和存活情况，以及与野外种群的遗传关系和生态关系，可科学评估增殖放流效果，对渔业资源管理具有较强的指导性。本文介绍了当前几种常用的鱼类标记技术，比较各标记技术的优缺点，并对适合人工增殖放流的大规模标记技术进行了综述，旨在为不同背景下的放流标记技术的选择提供参考。

1 常用鱼类标记技术

1.1 挂牌标记

挂牌标志是将写有标志鱼信息的挂牌用专门材料（不锈钢丝、聚酯纤维等）固定在鱼体上，依据固着方式不同，可分为3类：穿体标、箭形标和内锚标，前2类标常常固着在鱼体背部肌肉，后者则固着在鱼体腹部[2]。挂牌标志操作方法较简单，成本低，且肉眼可识别，因此被广泛应用，但一般用于个体较大的鱼，如体长在15 cm以上的[3]，因为小型鱼类可能难以忍受固着时的操纵压力，难以承受额外的代谢负担[4]。但国内学者成功应用标志牌标记全长7 cm以上的牙鲆（Paralichthys olivaceus）[5]和褐牙鲆[6]，对全长10 cm以上的半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）也可用T型标志牌标记[7]。在利用标志牌对放流鱼进行标记时，不可避免地在鱼体标志部位形成伤口，若标记后不经处理直接放入野外环境中，标志鱼的标志部位容易恶化，形成坏死，直接导致实验鱼的死亡或生长抑制[8]。黄国光等[9]研究发现标志部位对黄鳍鲷（Acanthopagrus latus）幼鱼的存活有显著影响，以背鳍棘基部肌肉标志的存活率最高，而背鳍条基部肌肉标志的存活率最低。

1.2 被动整合式雷达标

被动整合式雷达标（Passive integrated transponder，PIT）在鱼类上的应用始于20世纪80年代，该标志系统包括标、励磁系统和信号接收与处理单元[10]。每个PIT标都对应一个惟一的由字母数字组成的编码，通过专门注射器将其注入鱼体肌肉或腹腔而实现标记，可直接用便携式检测器扫描确认，应用范畴极为广泛[11]。探讨PIT标记鱼类的存活生长情况和标志保留率是评价该标记方法是否适用于被标记对象的重要指标。研究表明PIT标记死亡主要发生在标记后10 d内[12，13]，一般标记死亡的鱼类都规格偏小的，如体重小于3 g的金头鲷（Sparus aurata）[14]和尼罗罗非鱼（Tilapia nilotica）[12]标记后都有极高的死亡率。标记后一段时间内的生长抑制现象在几种鲑科鱼类上明显存在[15]，但随后的补偿生长能弥补前期不足[10]。PIT标志保持率与标记鱼类大小密切相关，Acolas等[15]对叉长57～63 mm的褐鳟（Salmo trutta）PIT腹腔标记，脱标率超过20%，而Prentice等[10]和Matthew[13]发现叉长56～190 mm的大鳞大马哈鱼（Oncorhynchus tshawytscha）PIT标志保持率可达99%～100%。

1.3 耳石标记

1.3.1 耳石化学标记 耳石化学标记主要是使用与钙具有亲和性的荧光化合物作用于标记对象，使其沉积在耳石上以形成在荧光显微镜下可识别的荧光标志[16]。自Douglas等[17]发现盐酸四环素（TC）可沉积在鱼类骨骼和鳞片上，便开始了鱼类耳石化学标记的系统研究，化学标记可在鱼类任何生活史包括受精卵阶段开展，且耳石标志永久保存[18]，常用于大规模标记[19]。至今已筛选出可用于标记的常用物质有土霉素（OTC）、盐酸四环素、茜素络合物（ALC）、茜素红S（ARS）、钙黄绿素等[19]，四环素类是使用时间最长的标记物质，但标记效果却稍逊于ALC和ARS[20，21]，钙黄绿素能较好地标记很多鱼类，但其使用的安全浓度较小，作用时间不易掌握[22]。

标记途径有注射、浸泡或投喂含有标记物的饲料，研究表明茜素投喂或注射的标记效果都不理想[23]，而浸泡标记效果明显[24]，而钙黄绿素通过注射的标记效果优于浸泡[25]。选用何种标记物及标记手段一般主要根据标记鱼的大小、生活史阶段、标记数量及资金预算等综合考虑[26]。

1.3.2 耳石热标记 鱼类耳石能准确记录生活史中的经历事件，如温度波动、摄食及饥饿、光周期等，通过阅读耳石轮纹生成的周期性、宽度及光密度等信息即可推断历史背景[27]。耳石热标记是通过人为短期地对水温进行调控以改变耳石上的一个或多个生长轮纹的特征，形成终身可识别的标记[28]。Brothers[29]首先发现红点鲑耳石生长纹特征与水温变化密切相关，形成的特殊轮纹可被永久识别，Bergstedt等[30]对此进行了印证。随后，耳石热标记在大西洋鲑（Salmo salar）[31]、太平洋鮭（Oncorhynchus）[32]、胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）[33]等鱼类上成功应用。仅仅通过人工调控温度波动就能对胚胎、仔鱼耳石进行有效地大规模标记，方法简单，且费用低廉。该标记技术已在世界范围内得到广泛推广使用[27]。

1.4 微卫星DNA标记

微卫星DNA又称简单重复序列，是由1～6个碱基组成的短串联重复序列，其座位高度丰富，变异率高并且散布于整个真核生物基因组[34]。微卫星技术是近年来广泛应用的DNA标记技术，利用它制备的DNA指纹图谱也具有极高的个体特异性，这些特点使得它尤其适合于亲子鉴定和血缘关系分析方面的应用[35]。筛选出多态性高的微卫星位点，并根据它们的序列设计出合适的PCR引物，就可对物种身份进行精准的无损鉴定分析。国内学者已对鳙（Aristichthys nobilis）[36]、长薄鳅（Leptobotia elongata）[37]、鲈鲤（Percocypris pingi）[38]、胭脂鱼[39]等鱼类的微卫星位点进行了筛选，为应用微卫星标记评估增殖放流效果奠定了基础[40]。目前的微卫星亲子鉴定方法主要来源于对人类的研究，分析软件对常规二倍体的物种支持率很高，而对鲈鲤等这样的四倍体或其他多倍体物种的支持率较低。需要探索新的方法，而且需要降低成本。

2 常用鱼类标记技术的比较

标记效果是衡量一种标记技术的重要指标，通常选取标记对象的存活率、生长情况及标志保持率等参数。不同鱼类规格大小对标记效果影响甚大，因此，选择合适的标记规格是某种标记技术成功应用的前提。相比耳石标记和微卫星标记，挂牌和PIT标记主要针对大规格鱼种，若对规格偏小的鱼类，其存活率、标志保持率都将降低，且生长受抑制[15]，因需要对标记对象逐尾进行标记，劳动强度大，不宜大规模标记；但二者标记检测相对简单，都可做到无损、快速检测。耳石标记最大的优点就是可以大规模批量处理标记样本，劳动强度低且标记效果好[19]，但标记检测需要取出耳石，利用荧光显微镜或光学显微镜逐一识别，工作量大。而对于微卫星标记，无需进行任何形式的物理标志，对鱼体没有伤害，并且终生存在而不影响鱼类生活史[40]，但亲本和子代遗传信息提取耗时费钱，专业门槛高。表1对常用标记技术做了一简单比较，为标记技术的选择提供参考。

3 大规模标记技术研究及应用

本文主要以耳石标记为例，综述当前大规模标记研究现况。

3.1 标记方法的建立

药品浓度与浸泡时间是耳石化学标记方法建立的关键参数，与标记效果成正比[24]，通常是以最低死亡率和最好标记效果为依据[22]。研究表明不同鱼类对药品的敏感性不一致，药品使用浓度差异较大，虹鳟（Oncorhynchus mykiss）仔鱼ALC的使用浓度超过20 mg/L就会有较高的死亡率[24]，而日本牙鲆ALC使用浓度可达到300 mg/L[41]。已有研究表明，对于不同种类的鱼ALC使用浓度范围为25～800 mg/L[20，42]，一般具体到某种鱼类都需做预实验。

热标记可以通过降温或升温而实现耳石标记。一般水温突然降低2 ℃，持续4～24 h就能在耳石上产生明显的暗纹[32，43]，暗纹密度与降温幅度和低温持续时间高度相关，温差变化越大，或低温持续时间越长，耳石上暗纹的光密度就越大[44]。通过加热使水温高于环境水温，期间形成一宽带低光密度的耳石轮纹，与低环境水温下产生的窄带高光密度的轮纹差异明显[45]。升温2.5 ℃即可产生较好的标记效果[27]，Bergstedt等[46]报道12 h热周期下可形成标记，但Volk等[27]认为小于24 h热周期的标记效果都不好，延长热周期至48 h能产生非常清楚的亮带。

3.2 在人工增殖放流中的应用

耳石标记能一次性大规模标记仔稚鱼及受精卵，在人工增殖放流中的应用前景广阔。但不管是耳石化学标记或是热标记，在放流标记前，都需要在实验室建立标记方法，明确关键标记参数。Baer等[47]用150 mg/L的ARS成功标记放流褐鳟1万尾，Caraguel等[48]也用150 mg/L的ARS标记放流欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）36万尾，7个月后成功回捕检验了放流效果。相比耳石化学标记，热标记在国外增殖放流中应用较多，Munk等[49]报道在1988～1998年期间，北太平洋沿岸国家热标记放流大量鲑鳟鱼苗，俄罗斯热标记放流约880万尾，加拿大标记约1.2亿尾，而美国标记超过60亿尾。杨君兴等[1]报道在2007～2009年间，中国在近海海域和内陆重要江河湖泊放流各类重要水生生苗种636.6亿尾（粒），2010年共放流苗种289.4亿尾，但标志放流个体比例少。

近些年，国内科研院所在实验室内也探索建立了大规模标记技术，但推广应用至大型增殖放流实践中的力度不够，2012年雅砻江流域水电开发有限公司委托四川大学在锦屏·官地水电站鱼类增殖放流站开展标记放流技术研究及应用，2013～2014年间应用热标记技术成功标记出膜15 d后的短须裂腹鱼（Schizothorax wangchiachii）仔鱼约21万尾，占当年放流鱼苗总量的1/4；2015年使用20～40 mg/L的茜素红S溶液先后分7批，成功浸泡标记短须裂腹鱼苗约60万尾，占放流鱼苗总量的50%。

4 存在的问题及建议

鱼类标记技术发展至今已有几十种，有简单的物理标记，也有复杂的分子标记。一种理想的标记技术至少应具备以下特点：①标记后鱼苗死亡率低；②标记保留时间长；③标记易识别；④能大规模标记且劳动强度低；⑤标记费用低。但目前所有的标记技术在使用中都存在一定的缺陷，如挂牌、切鳍等传统标记技术最大的缺陷就是对鱼造成机械性损伤，劳动强度大，不宜大规模标记；而耳石标记或分子标记等大规模标记手段的标志又不易直接识别；分子标记价格较为昂贵，通常需要专业的科研人员才能实施，不利于大规模的推广。寻找一种能够从外观上快速识别标记个体，又能够包含丰富信息的标记技术，同时花费低廉，是鱼类标记技术研究的目标，但事实上却困难重重。因而，利用现有标记手段，针对不同的放流种类和研究目的，选择合适的标记技术才是切实可行的。

对于繁殖亲本或中华鲟等国家级珍稀鱼类时，可以使用PIT标签，便于追踪和識别，能对个体进行精细化管理。而标记数十万的放流个体，则应重点考虑适合大规模标记的方法。短期研究较大规格放流鱼苗的生长情况，则可以在鱼体皮下注射荧光染料，直接肉眼辨识即可。

参考文献：

[1] 杨君兴，潘晓赋，陈小勇，等.中国淡水鱼类人工增殖放流现状[J].动物学研究，2013，34（4）：267-280.

[2] 张堂林，李钟杰，舒少武.鱼类标志技术的研究进展[J].中国水产科学，2003，10（3）：246-253.

[3] JOHN R W，DENNIS J D，MARK T M. Notes：A morphological explanation for size-dependent anchor tag loss from striped bass[J].Transactions of the American Fisheries Society，1990， 119（119）：920-923.

[4] NIELSEN L A.Methods of Marking Fish and Shellfish[M].New York：American Fisheries Society，1992.

[5] 刘芝亮，徐永江，柳学周.T型标志牌标记牙鲆苗种[J].渔业科学进展，2013，34（6）：80-86.

[6] 刘 奇.褐牙鲆标志技术与增殖放流试验研究[D].山东青岛：中国海洋大学，2009.

[7] 柳学周，徐永江，陈学周，等.半滑舌鳎苗种体外挂牌标志技术研究[J].海洋科学进展，2013，31（2）：273-280.

[8] OTTER？魡 H，KRISTIANSEN T S，SV？魡 SAND T. Evaluation of anchor tags used in sea-ranching experiments with atlantic cod （Gadus morhua L.）[J].Fisheries Research，1998，35（3）：237-246.

[9] 黄国光，梁伟峰，王云新.穿体标志对黄鳍鲷幼鱼的生存、存活及脱标的影响[J].广东海洋大学学报，2009，29（1）：31-35.

[10] PRENTICE E F，FLAGG T A，MCCUTCHEON C S. Feasibility of using implantable passive integrated transponder（PIT） tags in salmonids[A].Fish-Marking Techniques[C].Bethesda，Maryland：American Fisheries Society Symposium，1990，7：317-322.

[11] CUCHEROUSSET J，PAILLISSON J M，ROUSSEL J M. Using PIT technology to study the fate of hatchery-reared YOY northern pike released into shallow vegetated areas[J].Fisheries Research，2007，85（1/2）：159-164.

[12] BARAS E，WESTERLOPPE L，M？魪LARD C，et al. Evaluation of implantation procedures for PIT tagging juvenile Nile tilapia[J].North American Journal of Aquaculture，1999，61（3）：246-251.

[13] MATTHEW R D. Mortality and long-term retention of passive integrated transponder tags by spring chinook salmon[J].North American Journal of Fisheries Management，2003，23（3）：1015-1019.

[14] NAVARRO A A，AFONSO J M，OLIVA V，et al. Evaluation of PIT system as method to tag fingerling of gilthead seabream （Sparus auratus L.）：Effects on growth，mortality and tag loss[J].Aquaculture，2007，257（1/4）：309-315.

[15] ACOLAS M L，ROUSSEL J M，LEBEL J M，et al. Laboratory experiment on survival，growth and tag retention following PIT injection into the body cavity of juvenile brown trout （Salmo trutta）[J].Fisheries Research，2007，86（2）：280-284.

[16] MONTGOMERY S S，BRETT P A. Tagging eastern rock lobsters Jasus verreauxi：Effectiveness of several types of tag[J].Fisheries Research，1996，27（4）：141-152.

[17] DOUGLAS D W，GEORGE J R. The deposition of tetracycline drugs in bones and scales of fish and its possible use for marking[J].The Progressive Fish-Culturist，1962，24（4）：150-155.

[18] BROTHERS E B. Otolith marking[J].American Fisheries Society Symposium，1990，7：183-202.

[19] TAYLOR M D，FIELDER D S，SUTHERS I M.Batch marking of otoliths and fin spines to assess the stock enhancement of Argyrosomus japonicus[J].Journal of Fish Biology，2005，66（4）：1149-1162.

[20] TSUKAMOTO K.Otolith tagging of ayu embryo with fluorescent substances[J].Nihon-Suisan-Gakkai-Shi，1988，54（8）：1289-1295.

[21] SZEDLMAYER S T，HOWE J C. An evaluation of six marking methods for age-0 red drum，Sciaenops ocellatus[J].Fishery Bulletin，1995，93（1）：191-195.

[22] RONALD C B，ROY C H，CHRISTOPHER C K.Mass-marking otoliths of larval and juvenile walleyes by immersion in oxytetracycline，calcein，or calcein blue[J].North American Journal of Fisheries Management，1994，14：143-150.

[23] THOMAS L M，HOLT S A，ARNOLD C R. Chemical marking techniques in larval and juvenile red drum（Sciaenops ocellatus） otoliths using different fiuorescent markers[A].Recent Developments in Fish Otolith Research[C].Columbia：University of South Carolina Press，1995.703-717.

[24] BRYAN V D W，ROBERT A F.Otolith marking of rainbow trout fry by immersion in low concentrations of alizarin Complexone[J].North American Journal of Fisheries Management，2003，23（1）：141-148.

[25] JR J P M.NOTES：Comparison of calcein and tetracycline as chemical markers in summer flounder[J].Transactions of the American Fisheries Society，1993，122（2）：298-301.

[26] ERIC G U，MICHAEL L B，KEVIN L. Oxytetracycline marking efficacy for yellow perch fingerlings and temporal assays of tissue residues[J].The Progressive Fish-Culturist，1997，59（4）：280-284.

[27] VOLK E C，SCHRODER S L，GRIMM J J. Otolith thermal marking[J].Fisheries Research，1999，43（1-3）：205-219.

[28] VOLK E C，HAGEN P. An overview of otolith thermal marking[C].North Pacific Anadromous Fish Commission Technical Report 3：workshop on salmonid otolith marking，Seattle. 2001.1-2.

[29] BROTHERS E B. Otolith marking techniques for the early life history stages of lake trout. great lakes fishery commission，research completion report[J].Ann Arbor，Michigan，1985.

[30] BERGSTEDT R A，ESHENRODER R L，BOWEN C，et al. Mass-marking of otoliths of lake trout sac fry by temperature manipulation[A].Fish-Marking Techniques[C].Bethesda，Maryland：American Fisheries Society Symposium，1990，7：216-223.

[31] MOSEGAARD H，STEFFNER N G，RAGNARSSON B.Manipulation of otolith microstructures as a means of mass-marking salmonid yolk sac fry[A].Proceedings of the Fifth Congress of European Ichthyologists[C].Stockholm，Sweden，1987：213-220.

[32] VOLK E C，SCHRODER S L，FRESH K L. Inducement of unique otolith banding patterns as a practical means to mass-mark juvenile Pacific salmon[A].Fish-Marking Techniques[C].Bethesda，Maryland：American Fisheries Society Symposium，1990，7：203-215.

[33] SONG Z，HE C，FU Z，et al. Otolith thermal marking in larval Chinese sucker，Myxocyprinus asiaticus[J].Environmental Biology of Fishes，2008，82（1）：1-7.

[34] TAUTZ D，RENZ M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Nucleic acids research，1984，12（10）：4127-4138.

[35] 朱 斌，常劍波.微卫星DNA及其在鱼类中的应用[J].水生生物学报，1999，23（6）：721-728.

[36] 鲁翠云，孙效文，梁利群.鳙鱼微卫星分子标记的筛选[J].中国水产科学，2005，12（2）：192-196.

[37] LIU D，WU J，DENG L，et al. Development of microsatellite markers for Leptobotia elongata（Cypriniformes：Cobitidae） using 454 sequencing and cross-species Amplification[J].Pakistan Journal of Zoology，2014，46（4）：1147-1151.

[38] DENG Y，YANG K，GAN W，et al. Development of 12 tetranucleotide microsatellite markers for the tetraploidy fish Percocypris pingi，（Tchang）[J].Conservation Genetics Resources，2014，7（1）：99-101.

[39] 杨 忠，史 方，阙延福，等.胭脂鱼微卫星富集文库的构建及其应用前景展望[J].水生态学杂志，2009，2（2）：107-111.

[40] 成为为，汪登强，危起伟，等.基于微卫星标记对长江中上游胭脂鱼增殖放流效果的评估[J].中国水产科学，2014，21（3）：574-580.

[41] LIU Q，ZHANG X M，ZHANG P D，et al. The use of alizarin red S and alizarin complexone for immersion marking Japanese flounder Paralichthys olivaceus（T.）.[J].Fisheries Research，2009，98（1-3）：67-74.

[42] SECOR D H. Larval mark-release experiments： potential for research on dynamics and recruitment in fish stocks[A].Recent Developments in Fish Otolith Research[C]. Columbia：University of South Carolina Press，1995：423-444.

[43] VOLK E C，SCHRODER S L，GRIMM J J，et al. Use of a bar code symbology to produce multiple thermally induced otolith marks[J].Transactions of the American Fisheries Society，1994， 123（5）：811-816.

[44] NEGUS M T. Thermal marking of otoliths in lake trout sac fry[J].North American Journal of Fisheries Management，1999， 19（1）：127-140.

[45] HAGEN P，MUNK K，VAN ALEN B，et al. Thermal mark technology for inseason fisheries management：a case study[J]. Alaska Fishery Research Bulletin，1995，2（2）：143-155.

[46] BERGSTEDT R A，ESHENRODER R L，BOWEN C，et al. Mass-marking of otoliths of lake trout sac fry by temperature manipulation[A].Fish-Marking Techniques[C].Bethesda，Maryland：American Fisheries Society Symposium，1990，7：216-223.

[47] BAER J，R？魻SCH R. Mass-marking of brown trout （Salmo trutta L.） larvae by alizarin： method and evaluation of stocking[J].Journal of Applied Ichthyology，2008，24（1）：44-49.

[48] CARAGUEL J M，CHARRIER F，MAZEL V，et al. Mass marking of stocked European glass eels（Anguilla anguilla） with alizarin red S[J].Ecology of Freshwater Fish，2015，24（3）：435-442.

[49] MUNK K M，GEIGER H J. Thermal marking of otoliths：the" RBr" coding structure of thermal marks[J].NPAFC Doc，1998， 367：19.