西罗莫司自乳化缓释微丸的制备及对淋巴细胞的作用研究

闻超，包明威



西罗莫司自乳化缓释微丸的制备及对淋巴细胞的作用研究

闻超，包明威*

（武汉大学人民医院, 湖北 武汉 430060）

采用挤出滚圆法，以羟丙甲基纤维素钠为主要骨架型缓释材料制备出西罗莫司自乳化缓释微丸，考察制备工艺中挤出速度、滚圆速度、滚圆时间对目标速率影响并对淋巴细胞作用的研究。结果表明：西罗莫司自乳化缓释微丸的目标收率为（92.8±2.51）%（=3），采用挤出速度为挤出速度为65 r·min－1；滚圆速度为650 r·min－1；滚圆时间为3 min最适宜；西罗莫司缓释微丸能够抑制淋巴细胞的增值的活性，随着时间增长，抑制作用增强。以上表明：采用该方法为西罗莫司缓释微丸研究提供新的方法。

西罗莫司；自乳化给药系统；微丸；制备工艺；淋巴细胞

西罗莫司，又名雷帕霉素，是从放线菌提取出来的一种三烯大环内酯类化合物[1]，目前临床上广泛应用于预防器官移植病人的急性排斥反应，这是由于与其他免疫抑制剂相比肾毒性和神经毒性明显减少，但是免疫抑制能较强大[2,3]。但是西罗莫司在水中几乎不溶，易溶于有机溶剂中，属于生物药剂学分类系统的Ⅱ类药物。目前市场上只有口服的单一剂型，而且在胃液中容易遭受胃酸破坏，导致口服生物利用度仅为14%[4],极大的阻碍了在临床上的广泛的使用。自乳化给药系统能够提高难溶性药物的生物利用度，缓释给药系统能使药物缓慢释放，提高药物的作用时间和减少药物的浓度的波动。

本实验采用挤出滚圆法制备西罗莫司自乳化缓释微丸，考察制备工艺对目标的收率的影响，并与淋巴细胞的作用进行研究，为西罗莫司的新剂型研究提供新的方法[5,6]。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

Capmul MCM（Abitec，USA）；二乙二醇单乙基醚（Transcutol® P）（Gattefossé，France）；聚氧乙烯醚-35氢化蓖麻油（CremophorEL-35）（BASF，Germany）；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）（Gattefossé，France）；微晶纤维素（MCC）(批号：160523，陕西省西安北方惠安化学工业有限公司)；乳糖（江苏省常州朗生生物工程有限公司）西罗莫司原料药（批号060705，福建科瑞药业有限公司）；羟丙甲基纤维素钠（HPMC）（K4M，中国卡乐康公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司）；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温-20）（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；噻唑蓝（上海碧云天生物科技有限公司）；二甲基亚砜（优等级：河南萨默生物科技有限公司）；胎牛血清（含量10%，上海酶联生物有限公司）；培养基（RPMI-160，赛默飞世尔中国有限公司）全制动酶联免疫分析仪（Uranus AE，深圳爱康公司）；西罗莫司片（批号:20161215,WyethPharmaceuticals Company）其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

多功能滚圆机（CGC-350，重庆市英格造粒包衣技术有限公司）；轴向单螺杆挤出机（E-50，重庆市英格造粒包衣技术有限公司）；台式微量高速离心机（H1650-W，湖南省长沙湘仪离心机仪器有限公司）；电子分析天平(FA1104，上海精科天平有限公司)；激光粒度分析仪（Zetasizer Nano ZS，英国马尔文公司）；二氧化碳恒温箱（BPN-150CW，深圳市赛亚泰科有限公司）；高效液相色谱系统（Agilent 1200）（四元泵、自动进样器、紫外检测器、Agilent化学工作站，美国Agilent公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（，河南省郑州长城科工贸有限公司）；水浴恒温振荡器（SHA-B 型，江苏荣华仪器制造有限公司）；酶联免疫分析仪（ELx800，美国BIO-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 自化微丸的制备

精密称取微晶纤维素钠19 g、羟丙甲基纤维素钠20 g、乳糖31 g，按质量从小到大等量滴加，使混合、充分均匀。再加入30 g西罗莫司液体自乳化给药系统（Capmul MCM（油相）∶聚氧乙烯醚-35蓖麻油（表面活性剂）∶辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（表面活性剂）∶二乙醇单乙基醚（助表面活性剂）= 30∶28∶28∶14），快速搅拌，使充分混合均匀，即得到外观略有潮湿的混合物，加入12 mL的纯化水制备软材，将软材加入到微丸机中，在一定的挤出速度中挤出，挤出完毕后，迅速加入到一定转速的滚圆机中滚圆、收集所有制备的微丸于40 ℃的恒温烘干机中恒温干燥24 h，过18～24目的筛，即可。

2.2 自乳化缓释微丸的粒径分析和目标收率

采用筛分法测定缓释微丸的粒径分布范围，分别收集大于16目、16～24目、24～40目和小于40目的缓释微丸，称重，计算不同粒径范围的收率，其中16～24目为我们的目标收率。

2.3 雷帕霉素自乳化微丸的重分散性

分别取适量的西罗莫司液体自乳化给药系统和适量的西罗莫司自乳化缓释微丸加入到20 mL的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中，在磁力搅拌器（37±1）℃中快速搅拌24 h, 使缓释微丸充分裂解，待稳定后，在离心机以5 000 r·min-1离心5 min后，取上层液体，用纳米激光粒度仪测定形成乳液的粒径和多分散系数。

2.4 微丸制备工艺的考察

在微丸的制备过程中，微丸的制备工艺对微丸的目标收率[7]影响较大，所以选择挤出速度、滚圆速度、滚圆时间作为考察对象，考察各自对目标收率的影响。

2.4.1 挤出速度

在微丸制备工程中，软材的挤出是制备的第一步，也是关键的步骤，本次研究挤出速度分别在25、45、65 r·min－1时对目标粒径的收率影响。

2.4.2 滚圆速度

滚圆速度是通过提供剪切力来影响微丸圆整度的关键因素，考察滚圆速率为 500、650、800 r·min－1时目标粒径微丸的收率。

2.4.3 滚圆时间

滚圆时间对微丸的成型性有较大影响，考察时间分别为 1、3、5 min时目标粒径微丸的收率。

2.5 人淋巴细胞的培养

采集健康成人外周血，采用密度梯度离心法分离获得外周血的单个核细胞，将单个核细胞置于CO2浓度为5%、温度为 （37±1）℃的培养箱内培养 6 h 后，分离，取上层即为所需细胞。用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）继续培养待用[8]。

2.6 实验对照

将上层悬浮细胞按1×109/ L的浓度接种于 96 孔培养板中，取西罗莫司原料药制备成20μg/L，西罗莫司片和西罗莫司缓释微丸液配制成含有西罗莫司为20μg/L，实验分组可为3组，1个对照组( 西罗莫司原料药) ，1个试验组(西罗莫司片)、和另外1个实验组（西罗莫司自乳化缓释微丸)。取每组设 5 个复孔，置入温度为 （37±1）℃ 、浓度为5%的CO2培养箱中培养，培养 12，24，48，72，96 h 后，每孔加入 0. 5 g的L-1MTT 20 μL，继续至于5%浓度的CO2培养箱中培养4 h 后，弃去上清液，每孔中加入二甲亚砜（DMSO） 200 μL，在576 nm下，用酶联免疫分析仪检测的相应数值。计算实验组和两组对照组中对应的淋巴细胞增殖抑制率 ( % ) =( 1－实验组) /A对照组×100%。

3 实验结果

3.1 自乳化微丸的重分散性研究

由表1可见，西罗莫司自乳化缓释微丸遇水重分散后形成稳定的乳剂，粒径与液体自乳化比较有较小幅度的增大，但是仍在100 nm范围内，这表明自乳化微丸基本保持了液体自乳化给药系统的优点；但多分散系数也稍有增大，原因可能是：自微乳给药系统在溶剂中乳化的过程中受到辅料的影响，多分散系数增加，导致粒径稍大。

表1 粒径和多分散系数对比（，n = 3）

3.2 微丸制备工艺的考察

3.2.1 挤出速度

图1 挤出速度对微丸收率的影响

由图1可以看出，随着挤出速率的增加，挤出的力度明显增加，导致物料间的空隙较小，所以形成的粒径也相对较小，导致在目标粒径范围的比例增多，且各目标收率间均具有显著性差异，因而选择65 r·min－1为挤出速度。

图2 滚圆速度对微丸收率的影响

3.2.2 滚圆速度

由图2可以看出，当滚圆速度过大时，产生的细粉多，这是由于剪切力过大；当滚圆速度过慢时，滚圆产生的哑铃状及棒状微丸较多，这是由于剪切力不够。由于各目标收率间均具有显著性差异，所以选择650 r·min－1的滚圆速度。

3.2.3 滚圆时间

图3 滚圆时间对微丸收率的影响

由图3可以看出，滚圆时间过短，导致挤出物呈哑铃状居多，这是由于挤出条状物受力不充分；滚圆时间过长导致微丸与微丸之间相互粘连，容易形成更大粒径的微丸。由于各收率间均具有显著性差异，这是由于长时间受到挤压力，导致微丸间相互黏连。所以选定滚圆时间为3 min。

所以采用，在自乳化缓释微丸的制备过程中，最佳的挤出速度为65 r·min－1，滚圆速度为650 r·min－1，滚圆时间为3 min。

3.3 自乳化缓释微丸的粒径分析和目标收率

采用筛分法测定粒径分布，结果显示：未见直径大于2.0 mm者，直径为1.2～2.0 mm的微丸占总量（12.5±0.25）%；直径为1.0～1.2 mm 的占总量（63.5±1.25）%，直径为0.8～1.0 mm的占总量（16.8±0.69）%（=3），直径＜0.8 mm的占总量（7.2±0.32）%，粒径较均匀，符合微丸的规定。所以采用该制备工艺，西罗莫司自乳化缓释微丸的目标收率为（92.8±2.51）%（=3）。

3.4 西罗莫司自乳化缓释微丸对淋巴细胞的作用

西罗莫司原料药在12～48 h内抑制作用迅速上升，达72.62%，至96 h抑制作用平缓达到83. 92%。西罗莫司自乳化缓释微丸相对于西罗莫司原料药和西罗莫司片而言，抑制的速度较慢，但是达到96 h时，抑制的效果更明显，这说明制备成缓释制剂，起到了缓慢释放药物的作用，能过显著提高药物的有效作用时间；这说明淋巴细胞增殖受到西罗莫司自乳化缓释微丸、西罗莫司原料药和西罗莫司片强大的抑制（表2）。

表2 各时间点西罗莫司自乳化微丸、西罗莫司片和西罗莫司原料药对人淋巴细胞的抑制率

自乳化制剂能过显著提高难溶性药物的浓度。西罗莫司自乳化缓释微丸的体外淋巴细胞增殖这与自乳化给药系统提高难溶性药物浓度有一定的作用。

4 结论

本文采用挤出滚圆法，以羟丙甲基纤维素钠为骨架型缓释辅料制备缓释微丸，考察挤出速度、滚圆速度和滚圆时间对微丸目标收率的影响；随着挤出速率的增加，单位时间内挤出的物料增多，且物料间较紧实，目标粒径微丸的收率增加，所以选择挤出速度为65 r·min－1；由于剪切力的作用；当滚圆速度过慢时，滚圆产生的哑铃状及棒状微丸较多，滚圆速度过大时，产生的细粉多所以选择滚圆速度为650 r·min－1的；滚圆时间需要受力充分，所以选择时间为3 min。

通过本实验研究表明：西罗莫司缓释微丸能够抑制淋巴细胞的增值的活性，随着时间增长，抑制作用增强，与西罗莫司原料药和西罗莫司片相比较，能够延长药物的作用时间。所以西罗莫司缓释微丸的血药浓度更加平稳，避免因血药浓度波谷和波峰变化产生的不良反应，提高了药物的安全性，为西罗莫司的制剂开发提供一种全新的思路。

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Preparation of Sirolimus Self-emulsifying Sustained Release Pellets and Its Effect on Lymphocytes

，BAO Ming-wei

（People's Hospital of Wuhan University, Hubei Wuhan430060, China）

Taking hydroxypropyl methyl cellulose sodium as main sustained-release material, sirolimus self-emulsifying sustained release pellets were prepared by extrusion spheronization. Effect of preparation process conditions including extrusion speed, spheronization speed, spheronization time on the target yield was investigated, and effect of the pellets on lymphocytes was studied. The results showed that, the yield of self-emulsifying sirolimus sustained-release pellets was（92.8+2.51）% (=3)；suitable preparation process conditions were as follows：the extrusion speed 65 r·min－1,the spheronization speed 650 r·min－1,the spheronization time 3 min. Sirolimus sustained release pellets can inhibit the activity of increased lymphocyte activity and increase the inhibitory effect over time. This method provides a new way for the study of sirolimus sustained-release pellets.

Sirolimus;self-emulsifying drug delivery system; Pellets; Preparation technique; Lymphocyte

R 945

A

1671-0460（2017）12-2493-04

2017-09-15

闻超（1986-），男，湖北孝感人，药师，研究生，研究方向：从事生物工程研究。E-mail：363428320@qq.com。

包明威（1974-），男，教授，医学博士，从事心脏电生理研究。