提高喷雾干燥益生菌发酵剂存活率的研究进展

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

提高喷雾干燥益生菌发酵剂存活率的研究进展

尚一娜，宋娇娇，王亚利，王俊国

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

喷雾干燥作为经济便捷的干燥方式被广泛应用于益生菌发酵剂的生产中。为了提高菌株的抗喷雾干燥性能，从分析喷雾干燥造成的损伤出发，探讨了如何从菌株培养条件、保护剂、喷雾干燥工艺等方面提高益生菌的存活率，旨为今后的商业化生产提供理论上的参考。

喷雾干燥；存活率；损伤；发酵剂

0 引言

随着发酵食品逐渐走入人们的视野，发酵剂作为制作发酵食品的关键所在也越来越受到人们的关注。但冷冻干燥法作为制备发酵剂的干燥方法，其耗时长、耗能多、成本较高，因而更加经济高效的喷雾干燥法成为目前大规模生产益生菌发酵剂最常用的方法[1]。但是经喷雾干燥法处理的菌株存活率较低且贮藏性较差，因而限制了这一方法的使用[2]。

诸多研究表明，益生菌虽然具有提高人体机能和健康水平的保健功能，但因其自身抗性较差，容易受到环境因素的影响而失去活性甚至死亡[3]。因此分析喷雾干燥给益生菌带来的伤害，研究如何提高菌株在喷雾干燥后的存活率和贮藏性是本文讨论的重点，同时也为益生菌发酵剂大规模商业化生产提供了理论依据。

1 喷雾干燥对菌株的伤害

1.1 高温对菌株的影响

在喷雾干燥的过程中，含有益生菌的料液被雾化，直接暴露于高温的空气中，高温会使细菌中的DNA、RNA、细胞膜以及核糖体等都受到不同程度的损伤[4]。其主要的损伤部位为细胞膜。研究发现，随着温度的升高，细胞膜中磷脂分子的脂酰链因运动加强而排列疏松，脂双层由液晶态转变为凝胶态，此时细胞膜的流动性和选择透过性变差，造成钾离子等内容物外渗从而导致细胞死亡。这种由液晶态转变为凝胶态的温度被称为膜相变温度Tm而且有研究表明相变温度相对低时细胞膜流动性较好。此外，经过高温处理的细胞蛋白质空间结构发生变性，酶活性随之下降甚至失活，这也是导致菌体存活率下降的重要原因[5]。

随着温度的升高干燥体系依次呈现出玻璃态、高弹态、黏流态这三种状态。在较低温度时物质是以非晶态形式存在，高分子链不能实现构象的转变，因粘度极大呈刚性固体，类似于小分子玻璃，故称为玻璃态。此状态下分子扩散速率很小，不利的化学反应能够被抑制，从而保护细胞免受不利条件的影响[6]。因此保持体系温度在玻璃态转变为高弹态的温度Tg以下就可以减少高温对细胞造成的损伤。

1.2 脱水对菌株的影响

益生菌发酵剂的喷雾干燥的基本流程是菌液先通过雾化器形成非常微小的雾滴，然后与干燥介质发生热交换和水分的传递，微滴表面的水分迅速蒸发，在很短的时间内被干燥成球状颗粒沉降于塔底。而随着自由水的蒸发完全，结合水开始从细胞中移除。在此过程中，许多亲水大分子物质或者膜脂质类物质发生改变。细胞膜脂双层的稳定性主要是依靠范德瓦耳斯力和斥力维持平衡，而水分的移除使得烃链的范德瓦耳斯力增加进而打破了这种平衡。所以当水分减少到一定程度时就会发生相变。相变会导致细胞膜功能失调从而增加了菌株的死亡率。迄今为止的研究表明，高温和脱水两方面的伤害是几乎同时协同作用于细胞上，但孰先孰后还有待进一步的研究。

1.3 物理伤害

喷雾干燥分为压力喷雾干燥法和离心喷雾干燥法。压力喷雾干燥主要采用高压泵将浓溶液通过雾化器（喷枪）雾化成雾状微粒喷入干燥室后与热空气接触快速脱水干燥。离心喷雾是利用在水平方向做高速旋转的圆盘给溶液以离心力，使其被甩出形成薄膜，细丝或液滴的同时与干燥介质接触干燥脱水，在地心引力的作用下落沉降于塔底。但无论选用哪一种干燥方法，如果喷嘴的压力过大或者离心转盘的转速过高就会产生剪切力使细胞膜破裂。因此，选择合适的转速和喷雾压力等喷雾干燥条件也是提高益生菌喷雾干燥能力的基本条件。

2 影响菌体存活率的因素

2.1 菌株特异性

诸多研究显示，在相同的喷雾干燥条件下，不同菌株的生存能力大相径庭[7]。这种差异其根本是来源于不同菌株的特异性。Golowczyc在对三株乳酸菌的研究中发现，在相同的热喷雾干燥条下，植物乳杆菌CIDCA 83114相较于Lactobacillus kefir CIDCA 8348和Saccharomyces lipolytica CIDCA 812具有较高的耐热性[8]；Corcoran[9]等人也对比了Lactobacillus rhamnosus E800、L.salivarius UCC 500和L.rhamnosus GG三种乳酸杆菌的耐热性。结果显示，Lactobacillus rhamnosus E800的耐热性为三者中最优。但Lee J等人通过对差式扫描量热法（DSC）温度记录图的分析，发现植物乳杆菌核糖体的热容低于大肠杆菌，所以大肠杆菌表现出了更好的耐热性[4]。出现这些现象的可能原因是在喷雾干燥这个高温低水分的环境下，由于细胞内的大分子物质如DNA、RNA及核糖体等受到影响，导致遗传物质的转录、翻译以及蛋白质的合成都相应发生了改变。

2.2 培养条件对菌体存活率的影响

2.2.1 培养基成分

对大多数益生菌来说，在培养过程中增强菌株的耐热性无疑是提高其喷雾干燥存活率的重点所在。在培养基中加入糖类，氨基酸类,季胺(如甘氨酸，甜菜碱，肉碱)可以在培养阶段提高菌株在干燥后的存活率[10-11]。Carvalho等人研究了不同碳源的培养基对菌株耐热性的影响。他们发现采用加入乳糖的培养基可以培育出耐热性很好的菌株；无独有偶，Potts和Silva的研究也证实添加了蔗糖的培养基可以提高活细胞的耐热性,进而提高喷雾干燥后的存活率[12,13]；早在1996年Kets的研究中，甜菜碱已经被证实可以在热干燥过程中起到对L.plantarum、L.halotolerans和E.fae⁃cium这三株菌株的保护作用，减少高温和脱水对细胞的损害。这种保护机理可能是在高热低水分的环境下，一些微生物会产生某些可溶性物质（即上述氨基酸糖类等）。这些物质会优先排出弥补水分的流失，维持因细胞外浓度高胞内浓度低而引起的渗透压不平衡。但是乳酸菌不能合成这类物质，而且在干燥这个相对短的过程中菌株也不能很好的积累该类可溶性物质，因此需要依靠外界去补充。所以，在菌株培养的过程中添加这些物质可以提高乳酸菌细胞膜的稳定性[14]。但更多的研究表明培养基的选择对干燥后菌株存活性的影响是因菌而异的[15,16]。

除此之外，还有研究表明不同糖类在发酵过程中产生的不同代谢物可以使菌株在抗喷雾干燥能力方面具有显著差异。例如，假性明串球菌mesenteroides菌经蔗糖和果糖的发酵可以产生甘露醇。而甘露醇可以在低水分的情况下保护细胞免受氧化性损伤[17]。还有研究表明，许多乳酸菌在培养过程中会产生蒴状的表多糖(EPS)黏附在细胞壁上。由于其本身具有良好的凝胶性质，相当于形成了玻璃态的保护层，从而在干燥脱水的过程中对细胞进行保护[18-19]。糖源的种类在很大程度上影响了表多糖的形成。当培养基的碳源为果糖，乳糖和蔗糖时都可以产生表多糖[20-21]。

2.2.2 应激反应

一般来说，菌株的耐热性与益生菌喷雾干燥的存活率成正相关。大量研究表明，菌株的耐热性主要是由细胞的热应激蛋白水平决定。热应激蛋白又称热休克蛋白，是一切生物细胞在受到热、病原体、理化有害因素等刺激后发生热休克反应，产生的一类生物进化上高度保守的蛋白质。它具有提高细胞的耐热性，维持细胞自稳状态的作用[22]。

除了热应激外，其他一些应激原如饥饿、缺氧、盐、酸、氧化、高渗等条件下，也可以诱导产生热应激蛋白[23]。处于不同生长期的菌株对干燥抗性有很大的差异，研究表明，生长对数末期和稳定期的菌株具有活菌数多且耐受性强的特点[24]。进一步的研究证实，处于稳定期的菌株因为营养物质的缺乏和有毒代谢产物的堆积，触发了应激反应，使其在喷雾干燥后具有更好的耐热性。酸或盐在一定程度上也可以提高了热应激蛋白的保护性[25]。将鼠李糖乳杆菌E800和短乳杆菌E1877处于稳定期的细胞，用亚致死酸性pH处理，也产生了耐热反应[26]；Desmond等人发现将Lac⁃tobacillu,rparacasei NFBC 338在0.3 mol/L NaCl的恒温溶液中处理30 min，可以增加菌株在喷雾干燥后的存活率[27]。

2.3 保护剂对菌体存活率的影响

添加保护剂被视为目前较为普遍的一种提高喷雾干燥后菌株存活率的方法。保护剂分为单一型和复合型。单一型的保护剂为各种糖类，包括果糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、山梨糖醇，海藻糖等。San⁃tivarangkna Higl和Foerst在2008提出了水置换和玻璃化理论阐明了糖类提高细胞膜稳定性的机制[28]。根据水置换假说,通过在双分子层表面的糖和磷酸羟基之间氢键的交互作用可以降低相变温度Tm[29]，维持细胞膜较好的流动性。例如，海藻糖可以在干燥过程中将酵母菌的Tm从60℃降低到40℃。当磷脂干燥脱水时,海藻糖在失水部位以氢键和磷脂的极性端相连，防止膜相变和复水时的渗漏，从而提高菌株的存活率。而玻璃化理论则认为加入糖类等保护剂可以使玻璃体化转变温度Tg升高，从而在较高的温度下保持体系仍处于玻璃态。同理，蔗糖和麦芽糊精的混合物可以保护L.bulgaricus菌株，将干燥后菌株存活率由0.01%提高到7.8%[30-31]。

成分复杂的复合型保护剂一般为脱脂乳、阿拉伯胶、谷氨酸钠和淀粉等[32]。Salar-Behzadi S等人在对Bifidobacterium bifidum BB-12进行喷雾干燥的研究中发现，添加阿拉伯胶，明胶或者果胶作为保护剂，可以一定程度上的提高菌体的存活率[5]。阿拉伯胶和果胶可以增强细胞膜中磷脂氢键的稳定性，从而起到保护细胞膜的作用[33]；明胶则可以在干燥后形成热可逆凝胶膜来保护细胞免受高温脱水带来的伤害[34]；Frit⁃zen-Freire等人的研究发现添加菊粉和果糖这类益生元可以在提高菌株Bifidobacterium bifidum BB-12喷雾干燥存活率的同时还能抵抗来自人体肠胃液低pH的侵袭。但是后期的研究表明，过高含量的益生元会导致产物颗粒变大干燥时间延长，从而增加了益生菌所受的热伤害，反而导致活菌数下降[35]。

2.4 喷雾干燥工艺对菌体存活率的影响

2.4.1 进、出口温度

在喷雾干燥过程中温度的变化主要分为两个阶段，一是恒定干燥速率阶段。该阶段液滴被热空气雾化，发生了热量传递，其温度很快升到一恒定值（即干燥空气的湿球温度）。由于其温度和热失活都受限于湿球温度，所以益生菌受进口温度影响较小，热损伤不严重。而在降速干燥阶段，此时的水分是外低内高，而温度梯度则是外高内低。当水分减少到一定程度时，在微粒表面就会形成玻璃体，水分蒸发的速率也因此逐渐下降。当微粒的温度与热空气温度达到一致时，干燥过程则停止。因此出口温度被认为是此阶段影响菌株存活率的主要因素[36]。Boza Y Barbin D在对Beijerinckia sp喷雾干燥存活率的研究过程中发现，出口温度会随着进口温度的升高而升高，所以尽可能维持较低的出口温度是降低Beijerinckia sp的死亡率的关键[37]。

2.4.2 进料流速、气流速度等

进料流速、气流速度、物料浓度、干燥时间等工艺条件都对出口温度有着或多或少的影响。通过调节这些工艺参数来降低出口温度，从而达到减少菌株损伤，提高菌株喷雾干燥存活率的目的。但是出口温度过低也会导致最终产品干燥不彻底，即水分含量过高、形态改变等后果[38]。所以适宜的出口温度对菌株存活率的影响力毋庸赘述。

2.4.3 喷雾气压/离心转盘转速

喷雾干燥过程中选用较低的喷雾气压也可以提高益生菌的存活率。在Riveros[39]等人的研究中，当喷雾气压从100 kPa降低到50 kPa时，益生菌Lactobacillus acidophilu的存活率由8.62 log CFU/g提高到9.48 log CFU/g。出现这种现象可能的原因是，当喷雾气压降低时，菌体在喷出时所受到的剪切力减少，从而减小了对益生菌Lactobacillus bulgaricus的伤害。该说法也在Lievense和Zhou等人的研究中得到证实[40-41]。但是一味的减小喷雾压力，会造成产物颗粒较大，使其与热空气接触时间变长，从而对菌株活性造成更为严重的热伤害。

与压力喷雾不同，离心喷雾不用高压，仅利用离心转盘的离心力也可以使菌液雾化。为了达到均匀干燥且菌株存活率高的目的，选择合适的转速十分重要。如果离心转盘转速过低，得到的喷雾液滴明显不均匀；如果过高则会因为离心力过大使得细胞膜破裂造成细胞死亡。所以，工业上圆盘的转速一般控制在3 000～20 000 r/min。

2.4.4 两段式干燥法

在喷雾干燥基础设备的干燥出口上再加一个流化床可以降低干燥温度，在减小热损伤的同时保证产品较低的水分含量，这种干燥方式被称为两段式干燥法。虽然两段式干燥体系比传统干燥设备体积大，但总体来说通过节省能源从而降低了开销，是目前应用较普遍的干燥设备之一。此外，两段式喷雾干燥设备制造的产品在复水过程中的分散性更好[42]。

2.5 复水条件对菌体存活率的影响

复水性被认为是益生菌发酵剂在复苏阶段的关键一步。有科学家研究指出不同的复水介质例如脱脂乳、MRS、去离子水或者磷酸盐缓冲液对活菌数没有显著的影响，但是复水温度对菌株有一定的影响力。Wang的研究中证实，在复水温度从4℃增加到50℃的过程中，L.bulgaricus的活菌数也随之增长。同样，Teixeira的研究也表明用发酵的豆奶复苏S.ther⁃mophilus和B.longum时，菌株的活菌数随复水温度的升高而增加[43]。

2.6 贮藏和包装对菌体存活率的影响

贮藏和包装也是影响喷雾干燥后菌株存活率的重要因素之一。众所周知，喷雾干燥后产物的稳定性随着贮藏的时间延长而减弱，而较低的温度可以将菌株的存活率维持在一个较高的水平[44]。例如，Morgan将抗氧化材料（抗坏血酸和谷氨酸钠等）加入Lactoba⁃cillus delbrueckii ssp.Bulgaricus的发酵剂中低温贮藏，发现其可以在一定程度上防止细胞膜脂肪酸的氧化和蛋白质的变性[45]。此外，包装对于储存菌株的重要性也不可忽视。真空或者充氮的包装更加适合储存例如Bifidobacteria这种厌氧型的益生菌，而且真空储存的效果要优于氮气和空气。

3 总结

在喷雾干燥过程中，由高温和脱水引起的伤害几乎同时作用于细胞上。其主要损伤的部位是细胞膜，而且对DNA，RNA和核糖体等也有一定程度的影响。同时喷雾干燥给细胞带来的物理伤害也不容小觑。因此，从菌体自身特异性的角度出发，选择合适的培养条件，添加糖类、脱脂乳和谷氨酸钠等保护剂都可以提高菌体抗喷雾干燥的能力；另外，较低的出口温度，适宜的喷雾压力等喷雾干燥条件也可以一定程度上保证较高的菌株存活率；喷雾干燥后成品的贮藏、运输和复水过程同样也影响着益生菌的存活率。适宜复苏菌种的复水温度是维持较高菌株存活率的重要条件。而加入抗坏血酸和真空包装也是目前为止保藏和运输发酵剂的两种有效手段。总体而言，虽然喷雾干燥会造成菌株一定程度上的死亡，但仍不失为目前制造发酵剂最经济实用的方法。在干燥益生菌发酵剂方面，人们更为期待一种在较低温度下即可进行热量交换的技术，以达到对菌株伤害最小化的目的。所以在设计多种复合型的干燥设备和开发新干燥技术这两方面都期待后人的进一步探索。

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Progress researches in improving the survival of probiotics starter cultures by spray drying technology

SHANG Yina，SONG Jiaojiao,WANG Yali,WANG Junguo
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018,China)

Spray drying process is a kind of high efficient method to produce probiotics starter cultures.In order to enhance the efficiency of probiotics using spray drying,this research firstly analyzes the damage of strains by spray drying and then discusses how to improve the surviv⁃al of probiotics,including culture conditions,protective agent,spray drying process and so on.Therefore it may provide some references for future commercial production.

spray drying;survival rates;damage;starter cultures

Q935

：B

：1001-2230（2017）07-0037-05

2016-09-21

国家自然科学基金项目(No.31160315)；内蒙古自然科学基金项目(2015MS0306)；中科院西部之光人才培养项目；国家自然科学基金项目(No.31660456)；农业部现代农业产业技术体系建设项目(CARS-37)。

尚一娜(1992-)，女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。

王俊国