降胆固醇活性花生多肽制备工艺的研究

宋玲钰，刘战伟，宗爱珍，贾 敏，徐志祥，徐同成，刘振华，杜方岭，刘丽娜

(1 山东省农业科学院农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室，济南 250100；2 山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271000；3 济南诚汇双达化工有限公司，济南 250101)

降胆固醇活性花生多肽制备工艺的研究

宋玲钰1，2，刘战伟3，宗爱珍1，贾 敏1，徐志祥2，徐同成1，刘振华1，杜方岭1，刘丽娜1

(1山东省农业科学院农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室，济南 250100；2山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271000；3济南诚汇双达化工有限公司，济南 250101)

以冷榨花生粕为原料，酶解制备具有降胆固醇活性的花生多肽。以体外结合胆酸盐的能力为指标，考察了酶的种类、温度、pH值、加酶量、酶解时间等因素对花生多肽降胆固醇活性的影响，确定最优蛋白酶为木瓜蛋白酶，通过正交试验的方法，确定了酶解花生粕制备降胆固醇活性花生多肽的最佳工艺条件为：温度50℃、pH 7.0、加酶量4 000 U/g底物、酶解时间4 h。

冷榨花生粕；酶解；花生多肽；降胆固醇活性

花生是我国重要的油料作物和经济作物，经冷榨技术得到的花生蛋白粕，营养和功能性都能较好的保存，对花生多肽活性的研究多集中在抗氧化活性和降血压活性[1-3]，对花生多肽的降胆固醇活性研究较少[4-6]，本试验以降胆固醇活性为指标，优化花生蛋白的酶解工艺，制备出具有降胆固醇活性的花生多肽。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

冷榨花生粕：青岛长寿食品有限公司；无水乙醚：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠、柠檬酸：国药集团化学试剂有限公司，分析纯；胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、糠醛、胃蛋白酶和胰蛋白酶：生工生物工程有限公司；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器及设备

ML104电子分析天平，梅特勒·托利多仪器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG-92435-III电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；FD-1B-80冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；S210数字pH计，上海雷磁仪器厂；HJ-6A磁力搅拌器，常州市国华电器有限公司；SHZ-D(III)循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；A-3SRJX箱式电炉，上海阳光实验仪器有限公司；DK-621数显恒温水浴锅，上海精宏实验仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冷榨花生粕成分检测 按如下标准进行检测：蛋白质含量测定《GB/T 5009·5-2010》；水分含量测定《GB/T 5009·3-2010》；脂肪含量测定《GB/T 5009·6-2003》；灰分含量测定《GB/T 5009·4-2010》。

1.3.2 花生多肽的制备 冷榨花生粕→碱溶(料液比1：10，50℃，3 h加3 mol/L NaOH调pH 8.5)→离心(3 500 r/min，10 min)→上层清液→酸沉(加3 mol/L柠檬酸调pH 4.5)→离心(3 500 r/min，10 min)→下层沉淀→溶解→酶解→灭酶→离心(3 500 r/min，10 min)→抽滤→调pH→冷冻干燥 →花生多肽[7]

1.3.3 花生多肽降胆固醇活性的测定 本试验采用糠醛显色法[8]测定反应过程中多肽对胆酸盐的络合作用，以多肽对胆酸盐、脱氧胆酸盐以及牛磺胆酸盐3种胆酸盐的吸附能力为指标，评价多肽的降胆固醇活性，以下方法以胆酸盐为例。

(1)胆酸盐标准曲线的建立：分别称取胆酸盐0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 g置于100 mL棕色容量瓶中，用去离子水溶解至刻度，配成胆酸盐标准溶液。

采用糠醛显色法测定胆酸盐的含量，取胆酸盐标准溶液2 mL，加入6 mL 40%硫酸溶液，振荡，加入1%糠醛溶液 1 mL，混匀，60℃温育40 min，待温度降到室温后，于620 nm波长处测吸光值，浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)多肽对胆酸盐吸附能力的测定：量取4 mL 1.6 mg/mL的胆酸盐溶液，分别加入0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL多肽溶液2 mL，37℃水浴保温1 h，待反应物降到室温后，4 000 r/min离心分离10 min。吸取上清液2 mL按糠醛显色法测其吸光度，由标准曲线计算上清液中胆酸盐浓度。计算公式如式(1)：

(1)

式(1)中：p1为胆酸盐溶液的初始质量浓度(mg/mL)；p2为吸附后胆酸盐溶液的质量浓度(mg/mL)。

1.3.4 花生多肽酶解工艺中酶的筛选 分别采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶酶解花生粕以降胆固醇活性为指标，设置不同浓度的多肽溶液，确定最优蛋白酶。水解的条件均按照蛋白酶说明书中推荐的最适条件(表1)。

表1 酶及水解条件

1.3.5 酶解条件的单因素试验 选取酶解温度、pH值、加酶量、酶解时间等4个因素，以降胆固醇活性为指标，探究合适的酶解条件。

(1)酶解温度对多肽降胆固醇活性的影响：水解酶为木瓜蛋白酶、pH 6.0、加酶量3 000 U/g、酶解时间 4 h，测定酶解温度为45、50、55、60、65℃时，不同浓度多肽溶液对3种胆酸盐的络合作用。

(2)pH值对多肽降胆固醇活性的影响：水解酶为木瓜蛋白酶、温度55℃、加酶量3 000 U/g、酶解时间 4 h，测定酶解pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.5时，不同浓度多肽溶液对3种胆酸盐的络合作用。

(3)加酶量对多肽降胆固醇活性的影响：水解酶为木瓜蛋白酶、温度55℃、pH为7.0、酶解时间4 h，测定加酶量为1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g时，不同浓度多肽溶液对3种胆酸盐的络合作用。

(4)酶解时间对多肽降胆固醇活性的影响：水解酶为木瓜蛋白酶、温度55℃、pH为7.0、加酶量为4 000 U/g，测定酶解时间为1、2、3、4、5h时，不同浓度多肽溶液对3种胆酸盐的络合作用。

(5)酶解条件对多肽降胆固醇活性影响的正交优化:根据单因素试验结果，以酶解温度、pH值、加酶量、酶解时间为试验因子，以降胆固醇活性为指标，将多肽溶液浓度设为10 mg/mL，作L9(34)正交表进行正交试验，确定花生蛋白酶解的最优工艺(表2)。

表2 正交试验因素水平

2 结果与讨论

2.1 冷榨花生粕成分分析

冷榨花生饼的主要成分分析详见表3。

表3 冷榨花生饼的主要成分 单位：%

2.2 胆酸盐、脱氧胆酸盐及牛磺胆酸盐标准曲线

胆酸盐、脱氧胆酸盐及牛磺胆酸盐标准曲线见图1。

图1 胆酸盐、脱氧胆酸盐及牛磺胆酸盐标准曲线

2.3 酶的筛选

由图2～4可见，木瓜蛋白酶的水解产物对胆酸盐、脱氧胆酸盐以及牛磺胆酸盐3种胆酸盐的吸附能力的抑制程度均为最高，且随着样品浓度即多肽浓度的增大，抑制程度也呈上升趋势，因此，选择木瓜蛋白酶水解较为理想。

图2 不同蛋白酶水解产物对胆酸盐 吸附能力的影响 图3 不同蛋白酶水解产物对脱氧 胆酸盐吸附能力的影响 图4 不同蛋白酶水解产物对牛磺 胆酸盐吸附能力的影响

2.4 酶解条件的单因素试验

2.4.1 酶解温度对多肽降胆固醇活性的影响 如图5～7可见，水解酶为木瓜蛋白酶、pH 6.0、加酶量 3 000 U/g、酶解时间4 h时，多肽对3种胆酸盐的吸附能力的抑制率均为最高，且随着多肽浓度的升高，抑制率也随之升高；超过55℃后，随着温度的升高，抑制率呈下降趋势。这可能是因为温度升高，酶蛋白结构发生变化，导致酶活性下降[9]。因此，选择55℃为最佳酶解温度。

图5 酶解温度对胆酸盐吸附 能力的影响 图6 酶解温度对脱氧胆酸盐 吸附能力的影响 图7 酶解温度对牛磺胆酸盐 吸附能力的影响

2.4.2 pH对多肽降胆固醇活性的影响 如图8～10所示，水解酶为木瓜蛋白酶、酶解温度为55℃、加酶量3 000 U/g、酶解时间4 h时，pH值从6.0到7.0，抑制率呈上升趋势，且随着多肽浓度的升高，抑制率也随之升高；再增大pH值，抑制率显著下降。这是因为该体系的pH值直接影响酶和底物蛋白分子的某些解离基团的离解状态，只有在特定的pH值条件下，酶和底物蛋白质的解离基团才处于结合和转化为产物的最佳解离状态[10]。因此，选择pH 7.0为最佳酶解pH。

图8 酶解pH对胆酸盐吸附 能力的影响图9 酶解pH对脱氧胆酸盐 吸附能力的影响图10 酶解pH对牛磺胆酸盐 吸附能力的影响

2.4.3 加酶量对多肽降胆固醇活性的影响 如图11～13所示，水解酶为木瓜蛋白酶、酶解温度为55℃、pH 7.0、酶解时间4 h时，随着酶用量的增加，抑制率增大，且随着多肽浓度的升高，抑制率也随之升高。但是当酶量高于4 000 U/g底物时，抑制率虽有所增加但趋于缓慢。考虑到经济性，因此，选择 4 000 U/g底物作为最优加酶量。

图11 加酶量对胆酸盐吸附 能力的影响 图12 加酶量对脱氧胆酸盐吸附 能力的影响 图13 加酶量对牛磺胆酸盐吸附 能力的影响

2.4.4 酶解时间对多肽降胆固醇活性的影响 如图 14～16所示，水解酶为木瓜蛋白酶、酶解温度为55℃、pH 7.0、加酶量为4 000 U/g时，在酶解的1～4 h里，抑制率随时间的延长呈上升趋势，且随着多肽浓度的升高，抑制率也随之升高。这主要是因为酶解开始时酶活力高，产物抑制小。4 h后抑制率增加趋势明显变缓。这表明随着水解时间的延长，酶活性逐渐降低，且游离肽的增多对产物的抑制增强[11]。

图14 酶解时间对胆酸盐吸附 能力的影响 图15 酶解时间对脱氧胆酸盐 吸附能力的影响 图16 酶解时间对牛磺胆酸盐吸 附能力的影响

2.5 酶解单因素的正交试验方案设计及结果

由表4～6可知，对胆酸盐、脱氧胆酸盐以及牛磺胆酸盐来说，反应条件的主次影响因素均为：pH值>酶解温度>酶解时间>加酶量，最佳因素组合为：温度50℃、pH 7.0、加酶量 4 000 U/g底物、酶解时间4 h。上述条件采用此工艺进行验证试验，RS值分别可达40.21%、71.96%、55.47%。

3 结论

木瓜蛋白酶制备降胆固醇花生多肽的最佳工艺条件：温度50 ℃、pH 7.0、加酶量4 000 U/g底物、酶解时间4 h，此方案下花生对胆酸盐、脱氧胆酸盐以及牛磺胆酸盐的抑制率即降胆固醇活性分别可达40.21%、71.96%、55.47%。◇

表4 正交试验方案设计及结果——胆酸盐

表5 正交试验方案设计及结果——脱氧胆酸盐

表6 正交试验方案设计及结果——牛磺胆酸盐

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(责任编辑 李燕妮)

Research on Preparation of Cholesterol Lowering Activity of Peanut Polypeptide

SONG Ling-yu1，2，LIU Zhan-wei3，ZONG Ai-zhen1，JIA Min1，XU Zhi-xiang2，XU Tong-cheng1，LIU Zhen-hua1，DU Fang-ling1，LIU Li-na1

(1Institute of Agro-food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science/ Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Products Deep Processing，Jinan 250100，China；2College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271000，China；3Jinan Chenghui-Shuangda Chemical Co.，Ltd.，Jinan 250101，China)

We prepared polypeptide with high cholesterol reducing activity by using cold pressed peanut meal as raw material.With its binding bile salts as an indicator in vitro，the experiment studied the effects of types of enzymes，temperature，pH value，enzyme quantity and enzyme time on the activity of the cholesterol lowering activity of peanut peptides.The results showed that the optimal protease was the papaya protease.The optimum technological parameters were temperature 50℃，pH 7.0，4 000 U/g substrate，and the hydrolysis time of 4 h.

cold pressed peanut meal；enzymatic hydrolysis；peanut polypeptide；cholesterol lowering activity

国家“863”计划项目(项目编号：2013AA102206)；山东省引进泰山学者海外特聘专家项目(项目编号：鲁财教[2012]45号)。

宋玲钰(1990— )，女，在读硕士研究生，主要从事花生多肽的分离纯化及其活性研究。

刘丽娜(1978— )，女，博士，副研究员，硕士生导师，主要从事花生多肽的分离纯化及其活性研究。