具有荚膜的白假丝酵母菌蛋白质组学分析*

唐晓媛，刘志春，马廉兰，张文平，王润秀

(赣南医学院 1.第一附属医院，江西 赣州 341000)

具有荚膜的白假丝酵母菌蛋白质组学分析*

唐晓媛1，刘志春，马廉兰，张文平，王润秀1

(赣南医学院 1.第一附属医院，江西 赣州 341000)

目的：研究从淋病患者阴道分泌物中分离鉴定的具有荚膜的白假丝酵母菌蛋白质组学特征。方法：采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离从淋病患者阴道分泌物中分离鉴定的具有荚膜的白假丝酵母菌(C1-4)和无荚膜的白假丝酵母菌(ATCC14053)的菌体蛋白质，用ImageMaster 2D platinum 7.0软件识别差异蛋白点，MALDI-TOF-MS鉴定差异蛋白。结果：C1-4与ATCC14053相比，显著差异表达蛋白点232个，其中180种蛋白表达明显上调，52种蛋白表达明显下调，质谱鉴定了32差异蛋白质点，8个得到鉴定，均在C1-4菌株显著表达。结论：具有荚膜的白假丝酵母菌与无荚膜的白假丝酵母菌菌株相比，蛋白质表达存在明显差异。

白假丝酵母菌；荚膜；蛋白质组学；2-DE；MALDI-TOF-MS

白假丝酵母菌(Candidaalbicans)为人类最常见的机会致病性真菌[1]。马廉兰等[2-3]从性病患者分泌物分离及鉴定了多株具有荚膜的白假丝酵母菌，并进一步研究发现具有荚膜的白假丝酵母菌与无荚膜的白假丝酵母菌在致病性、药物敏感性等方面存在明显的差异[4-5]，提示荚膜结构与白假丝酵母菌的致病性密切相关，但目前国内外对白假丝酵母菌荚膜的形成机制、结构成分等方面还未阐明。本研究采用蛋白质组学技术对比分析具有荚膜的白假丝酵母菌和无荚膜的白假丝酵母菌蛋白质表达水平的

差异，为进一步阐明白假丝酵母菌荚膜形成机制及致病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种 白假丝酵母菌国际标准株(ATCC14053)由北大医院真菌保藏中心(北京)提供，具有荚膜的白假丝酵母菌由本课题组从临床分离并经中国医学科学院皮肤病研究所鉴定，编号为C1-4。

1.1.2 主要仪器 酵母蛋白抽提试剂(康为世纪公司)，固相 pH 梯度干胶条 (IPGs，pH=3～10，GE)，乙腈(Fisher)，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、碳酸氢铵购自Sigma，胰酶、三氟乙酸购自Promega，过硫酸胺 (AP)、二硫苏糖醇(DTT)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基胺基甲烷 (Tris)、丙烯酰胺(Acylamide)、尿素、甘氨酸、 甘油等均购自Amersham，十二烷基磺酸钠 (SDS)购自Promega， 溴酚蓝(BPB)、考马斯亮蓝R-250等购自Bio Basic Inc，其余均为国产分析纯或色谱纯试剂。

1.1.3 主要仪器 冷冻离心机(H5050R,湘仪)，超声仪(JY96-Ⅱn,宁波新芝生物科技股份有限公司)，分光光度计(318C+,上海沛欧)，等电聚焦仪(ETTAN IPGphor3,GE)，凝胶图像扫描仪(ScanMaker i800,MICROTEK)，凝胶图像分析软件(ImageMaster 2D platinum 5.0,GE)，质谱仪(Ultraflex III TOF/TOF)及分析软件购自德国Bruker Dalton公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白样品制备 分别取白假丝酵母菌C1-4、ATCC14053接种至SDA液体培养基，37 ℃振荡(120 rpm)培养48 h， 2 000×g离心5 min收集培养物，预冷PBS(pH 7.4)洗涤3遍。每个样本加入酵母蛋白抽提试剂(使用前加入PMSF，终浓度1 mM)，按照每50 mg样本加入500 μL试剂，冰浴20 min，超声破碎，然后13 400×g离心10 min取上清，加入4倍体积冷丙酮(-20 ℃)沉淀过夜。第二天13 400×g离心20 min，去上清，风干丙酮得蛋白团块，裂解液溶解后超滤至体积100 μL，加500 μL裂解液，再超滤，重复3次。利用分光光度计测定样品中蛋白质含量。

1.2.2 二维凝胶电泳 操作步骤主要按照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。吸取相应量的蛋白质与水化液(8 mol·L-1尿素、1%DTT、40 mmol·L-1Tris、1%IPG pH 3～10缓冲液、1×BPB)混合至总体积为460 μL，水化12 h后进行等电聚焦(500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 7 h)。等电聚集结束取出胶条并放入平衡管中，先后用10 mL平衡A液(50 mmol·L-1Tris-HCI pH 8.8、6 mmol·L-1尿素、30%甘油、0.2%DTT、1×BPB)和10 mL平衡B液(50 mmol·L-1Tris-HCI pH 8.8、6 mmol·L-1尿素、30%甘油、3%碘乙酰胺、1×BPB溴酚蓝)各平衡15 min。平衡后的IPG胶条转移至12.5%SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳，电泳结束后取胶进行考马斯亮蓝染色，实验重复3次。

1.2.3 凝胶图像分析 应用扫描仪以及软件扫描考马斯亮蓝染胶获取图像，ImageMaster 2D platinum 5.0软件比较分析具有荚膜的白假丝酵母菌与无荚膜的白假丝酵母菌的蛋白二维电泳图谱的差异，选取表达水平相差5倍以上的蛋白质点进行质谱分析。

1.2.4 质谱分析与鉴定 从胶中切取差异蛋白质点于0.5 mL EP管中， 50%甲醇120 μL(5 mL甲醇和50 mM 碳酸氢铵)脱色30 min， 50%乙腈 100 μL和100 mmol·L-1碳酸氢铵50 μL脱水30 min，冷冻抽干。加入20 ng·μL-1胰蛋白酶的4～8 μL，冰上吸胀60 min。吸去多余的胰酶，加入10 μL覆盖液(10%乙腈和50 mM碳酸氢铵)，37 ℃酶解12 h。取出酶切完的胶粒超声处理15 min，吸出覆盖液至0.5 mL EP管，加入60 μL抽提液(90%乙腈和2.5%三氟乙酸)脱水10 min。吸出抽提液至0.5 mL EP管，真空干燥。制备好的样品加入1.5 μL重溶液(30%乙腈和0.1%三氟乙酸)充分溶解肽段后挥发至原体积的1/3，加入0.5 μL基质，在质谱仪上进行分析，测出各个差异蛋白质点的肽指纹图谱。参数：UV波长为355 nm，重复速率为200 Hz，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500 Da，扫描质量范围为700～3 200 Da。测定结果利用Mascot软件检索NCBI数据库鉴定蛋白质。

2 结 果

2.1 二维凝胶电泳及图像分析 实验中用相同的条件通过3次独立的实验分别提取了C1-4和ATCC14053处理后样本的全组蛋白，建立了重复性、分辨率较高的白假丝酵母菌全组蛋白2-DE图谱，通过专业2-DE图像处理软件和数据统计分析，C1-4与ATCC14053相比，显著差异蛋白点232个，其中180种蛋白表达明显上调，52种蛋白表达明显下调(图1)。

2.2 差异蛋白质谱分析 从胶中切取32个差异蛋白点，进行质谱分析，利用Mascot查询NCBI数据库，如果Mascot分数>20分(P<0.05)则认为得到鉴定，否则视为未得到鉴定(图2)。在32个差异蛋白点中有8个点得到鉴定，即Possible sphingolipid long chain base sensory protein、14-3-3 protein homolog、Prohibitin、Thiamine thiazole synthase、Enolase 1、Protein BOB1、Spermidine synthase、Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，在C1-4中的表达水平均高于ATCC14053。这些差异蛋白质的详细信息见表1。

A: C1-4, 180 proteins were significantly higher than that in ATCC14053 labeled with number,B: ATCC14053, 52 proteins were significantly higher than that in C1-4 labeled with number.

Fig.1 2-DE maps of proteins fromCandidaalbicans

图1 白假丝酵母菌的二维凝胶电泳

A:Mascot search results and protein view of spot 1 B:Mascot database query result and scores of spot 1.

Table 1 Differential proteins dentified by MALDI-TOF-MS

3 讨 论

蛋白质组学技术的应用有助于更全面地理解蛋白质生物学行为的方式和过程 ，更深入地研究细胞的调控及各种生物学效应，该技术已应用于白假丝酵母菌的细胞壁结构成分组成、致病性、免疫性、菌株基因突变、药物敏感性等方面研究[6-11]。本研究利用蛋白质组学技术联合质谱技术分析具有荚膜的白假丝酵母菌和无荚膜的白假丝酵母菌的全组蛋白质差异，结果显示它们之间的蛋白质表达水平存在明显的差异，质谱鉴定出8个差异蛋白。

14-3-3蛋白是一个在真核生物中广泛表达的高度保守的酸性蛋白家族，由不同基因编码，主要以同源/异源二聚体形式存在[12]，该蛋白在酵母菌又称为BMH1，与白假丝酵母菌生长繁殖、碳代谢、毒力等密切相关[13-15]。prohibitin广泛分布于细菌、植物、酵母、原虫及哺乳类等各种生物细胞中，且具有高度的同源性，为一类新型的分子伴侣蛋白，在转录调控、新陈代谢、细胞增殖等方面发挥着重要作用[16]。烯醇化酶(Enolase 1)是糖酵解所必需的胞内酶，广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守，可刺激人体产生特异性免疫反应，为真菌感染的常用检测指标，也应用于疫苗研究[17-18]。Spermidine synthase属于氨丙基转移酶家族，是包括腐胺、亚精胺和精胺在内的多胺家族合成过程中的重要调节酶，且精胺广泛存在动植物组织中、某些真菌和细菌中，对动物的正常生长繁殖是必要的，但Spermidine synthase在真菌和细菌中的功能目前还不是很清楚[19]。BOB1蛋白为转录辅助激活因子，是B 细胞正常发育和免疫应答必不可少的蛋白质分子，在DNA复制过程中起着调控作用[20-21]。Thiamine thiazole synthase是合成硫胺素(维生系B1)的关键酶，在酵母线粒体DNA抗损伤方面起重要作用[22]。Possible sphingolipid long chain base sensory protein在真菌方面的功能目前不太清楚。

综上所述，本研究质谱鉴定的8个差异蛋白与白假丝酵母菌的生长繁殖、新陈代谢、致病性、免疫性等密切相关，均在有荚膜的白假丝酵母菌高表达，且有研究证实具有荚膜的白假丝酵母菌致病力强，并与荚膜厚度密切相关[4]，提示这些蛋白质可能与白假丝酵母菌的荚膜形成密切相关，间接地参与了白假丝酵母菌的致病。至于这些蛋白质如何参与白假丝酵母菌的荚膜形成以及致病有待进一步研究。

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Proteomic Analysis of Candida Albicans with Capsule

TANGXiao-yuan1,LIUZhi-chun2,MALian-lan2,ZHANGWen-ping2,WANGRun-xiu1

(1.ThefirstaffiliatedhospitalofGannanMedicalUniversity; 2.GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Objective: To study the proteomic characteristics of candida albicans with capsule isolated from vaginal secretions of gonorrhea patients. Methods: Two-dimensional gel electrophoresis(2-DE) was performed to separate proteins from candida albicans with capsule (C1-4) isolated from vaginal secretions of gonorrhea patients and the standard strain of candida albicans with no capsule(ATCC14053) respectively. ImageMaster 2D platinum 7.0 software was used to analyze 2-DE images and the differential protein spots between C1-4 and ATCC14053 were identified by MALDI-TOF-MS. Results: Campared with ATCC14053, 232 differential protein spots in C1-4 were detected; 180 proteins were significantly higher than that in ATCC14053; 8 proteins of which were identified by MALDI-TOF-MS; 52 proteins were significantly lower than that in ATCC14053. Conclusion: The protein expression of candida albicans with capsule was significantly different campared with candida albicans with no capsule.

Candida albicans; Capsule; Proteomics; 2-DE; MALDI-TOF-MS

江西省自然科学基金项目(20114BAB215023);江西省教育厅科技计划项目(GJJ10573、GJJ12550)

刘志春,男，硕士研究生，副教授，研究方向：医学真菌学。E-mail:lzc_96294@163.com

R379

A

1001-5779(2016)06-0864-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.008

2016-01-21)(责任编辑：敖慧斌)