HPLC法检测不同提取方法对脐橙果皮中橙皮甙含量的影响*

张 娟,黄志强,周鹏辉

(赣南医学院预防医学系,江西 赣州 341000)

HPLC法检测不同提取方法对脐橙果皮中橙皮甙含量的影响*

张 娟,黄志强,周鹏辉

(赣南医学院预防医学系,江西 赣州 341000)

目的：检测不同提取方法对橙皮甙含量的影响。方法：分别采用冷凝回流法和碱式提取法提取赣南脐橙果皮橙皮甙，采用高效液相色谱法对橙皮甙含量进行测定。采用ZORBAX C18柱，流动相为V(甲醇)∶V(0.5 %乙酸)=32∶68，流速0.4 mL·min-1，检测波长283 nm，采用外标定量法进行测定。结果：橙皮甙在浓度为10～30 mg·L-1范围内呈良好线性关系，相关系数R=0.993 4。冷凝回流法提取橙皮甙含量为4.18%，碱式提取法为1.18%。结论：冷凝回流含量高且纯度好。

高效液相色谱；橙皮甙；冷凝回流；碱式提取

橙皮甙(Hesperidin)又名橙皮苷(Hesperidion)、柑果甙( Citrus)，是由一分子橙皮素与一分子的芳香二糖缩水结合而成，其结构式为:C28H34O15。橙皮甙是一种浅黄色的结晶粉末，几乎无臭无味，熔点260 ℃，能溶于稀碱和吡啶及70 ℃以上的热水，微溶于甲醇，几乎不溶于丙酮、醚、苯和氯仿[1]，分子量为610.5 。橙皮甙属于双氢黄酮类化合物，存在于柑橘类和中草药(如陈皮、枳实等)中，是维生素P的主要成分，能保持微血管壁正常的渗透性，对心血管疾病有显著疗效。橙皮甙经甲基化后，可配制成

多种防动脉粥样硬化和心肌梗塞的药物[2]。据文献报道[3-6]：橙皮甙具有降低人体内胆固醇、抗氧化、防霉、降血压、抗病毒、抗肝炎、抗肿瘤、抗癌等功效。橙皮甙还是制备双氢黄酮类、黄酮类和二氢查耳酮类药物、天然抗氧化剂和食品添加剂(如低能甜味剂)的基本原料。因此，对橙皮甙的提取及其含量的测定研究是一个研究热点。本文采用高效液相色谱法对赣南脐橙中橙皮甙的含量进行测定。该方法具有简便、快速、准确、可靠等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260 高效液相色谱仪； KQ-100DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；蒸馏装置；超纯水(艾柯科学仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。

甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)；橙皮甙对照品(≥98%，天津一方科技有限公司)；无水乙醇(分析纯)；浓盐酸(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；浓盐酸(分析纯)；氢氧化钙(分析纯)。

橙皮甙标准储备液：称取0.001 25 g橙皮甙标准品，溶于少量的甲醇，转入10 mL容量瓶中，用甲醇定容，浓度为0.125 g·L-1。

脐橙产于赣南地区。

1.2 色谱条件 色谱柱：C18柱(ZORBAX，1.8 μm，50 mm×4.6 mm， Agilent);流动相∶V(甲醇)∶V(0.5 %乙酸)=32∶68；检测波长：283 nm；柱温：25 ℃；流速：0.4 mL·min-1。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理 用超纯水清洗橙皮，将清洗后的橙皮置于干燥箱中于38 ℃干燥24 h，将烘干后的橙皮用小型粉碎机进行粉碎，制成粉末状。

冷凝回流法：称取样品2.000 g，加入石油醚150 mL，80 ℃水浴回流2.5 h(脱脂)，弃去石油醚。样品待石油醚挥发干后加入甲醇160 mL提取，80 ℃水浴回流3 h，放置冷却，过滤。滤液置于250 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。

碱式提取法：用精密天平准确称取7.000 g,用70 mL蒸馏水浸泡，用玻璃板不断搅拌30～45 min使之充分吸水软化；量取55 mL饱和澄清石灰水于25 ℃浸入样品中，玻棒搅拌30 min后，用5 mol·L-1NaOH将pH调至pH 13.0，用纱布先过滤，过滤后的滤液再进行减压抽滤，除去橙皮渣,滤液用1 mol·L-1HCl中和调至pH 4.5，待有沉淀物生成，静置过滤，得粗橙皮甙。将10 mL 1%NaOH和90 mL 50%无水乙醇搅拌混合，再将粗橙皮甙加入，继续搅拌1 h使粗橙皮甙溶解完全，然后过滤至滤液澄清，用1 mol·L-1HCl中和调至pH 5.0，静置过夜，过滤，滤饼用50%无水乙醇洗涤一次，再用水洗至接近中性，得精制橙皮甙。将提取的橙皮甙样品，用0.45 μm有机系滤膜过滤后置于1.5 mL试剂瓶中待测。

1.3.2 测定方法 样品经滤膜过滤，取1 mL装入样品瓶中，放入HPLC仪中进行测定。以出峰时间定性，以峰面积定量(外标法)。

1.3.3 橙皮甙标准工作液的配制 分别准确量取0.125 g·L-1橙皮甙标准储备液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成浓度为10、15、20、25、30 mg·L-1的标准工作液。

2 结 果

2.1 色谱条件的选择 余晓等[7]采用C18柱(5 μm 200 mm×4.6 mm)，乙腈-0.4%磷酸溶液(体积比为20∶80)为流动相对遵义产金桔与脐橙果皮中橙皮甙含量进行了测定；李秀玲等[8]测定枳实和枳壳中的橙皮甙含量时，色谱柱为Hypersil ODS1柱(250 mm×4.6 mm),选用了乙腈-0.5%乙酸溶液(体积比为22∶78)为流动相；董朝青等[9]采用C18柱(5 μm 200 mm×4.6 mm)，流动相为甲醇和0.5%乙酸(体积比为32∶68)。本实验高效液相色谱法在色谱条件的选择上，首次选用ZORBAX C18柱(50 mm×4.6 mm ，1.8 μm)，甲醇和0.5%乙酸(体积比为32∶68)作为流动相对橙皮甙进行测定，发现此C18柱亦能有效地将橙皮甙进行分离，结果稳定可靠。标准品色谱图见图1，橙皮甙标准品的出峰时间为4.05 min。

2.2 精密度实验 选高浓度标准品溶液进样1 μL，连续5次，测定峰面积，峰面积RSD为4.27%，表明仪器精密度良好，见表1。

图1 标准品色谱图

2.3 标准曲线的绘制 在选择的色谱条件下，将配制好的标准工作液进样分析。以色谱峰面积为纵坐标，橙皮甙的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为：Y=21.708X-32.065，R2=0.998 5。由此可知橙皮甙在质量浓度为10～30 mg·L-1范围内呈良好线性关系。

2.4 样品测定 余晓等[7]采用醇类提取法，经HPLC法测定，测得遵义产金桔果皮中橙皮甙含量为4.60%，遵义产脐橙果皮中橙皮甙含量为5.25%；赵虹桥等[10]采用微波辅助法从槛柑果皮中提取橙皮苷，经紫外分光光度法测得橙皮苷得率为2.02%。本实验采用高效液相色谱法依上述色谱条件，取样品液1 μL进样，测定峰高，依标准曲线计算，可求出橙皮甙的含量分别为4.18%、1.18%,冷凝回流方法效果更佳。样品色谱图见图2、图3。

图2 冷凝回流提取橙皮甙色谱

图3 碱式提取橙皮甙色谱图

2.5 回收率试验 将橙皮甙标准品按照相同的方法进行处理，按色谱条件重复进样5次。两种不同提取方法测得平均回收率分别为98.10%、94.30%，RSD 2.19%、1.51%，结果见表2。

表2 回收率实验结果表

3 讨 论

HPLC法是利用高效液相色谱仪，选择适宜的色谱柱和流动相使橙皮甙和其它成分分离，以紫外检测器得到峰面积，由峰面积计算橙皮甙的含量的方法，具有应用范围广，稳定性好和灵敏度高，重复性高，高效相色谱柱可反复使用，自动化操作，定量精度高，测量准确等特点。

本实验首次采用ZORBAX C18柱(50 mm×4.6 mm，1.8 μm)，甲醇和0.5%乙酸(32∶68)作为流动相，用高效液相色谱法对赣南脐橙皮中的橙皮甙的含量进行了测定，发现此C18柱亦能有效地将橙皮甙进行分离，结果稳定可靠，检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好。

本实验分别采取冷凝回流法和碱式提取法对样品中橙皮甙进行提取，结果表明冷凝回流法提取率高于碱式提取法，从液相色谱图上可发现碱式提取的橙皮甙杂峰较多，说明样品中含有较多干扰物质，长期使用对仪器有损坏。因此，今后实验中可以用有机溶剂橙皮中橙皮甙进行提取，效果更佳。

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[7] 余晓,钱民章.HPLC法测定遵义产两种柑橘果皮中橙皮甙含量[J].遵义医学院学报,2005,28(2):175-177.

[8] 李秀玲,李龙,肖红斌,等.反相高效液相色谱法测定枳实、枳壳中橙皮甙和柚皮甙的含量[J].色谱,2002,20(6):585-586.

[9] 董朝青,钟世安,周春山，等.反相高效液相色谱法同时测定柚皮中柚皮甙和橙皮甙的含量[J].理化检验-化学分册,2005,41(1):44-46.

[10] 赵虹桥,文赤夫.湘西桠柑果皮中橙皮苷的提取与纯化[J].现代食品科技,2008,24(8)：812-815．

Effect of Different Extraction Methods on Hesperidin Content in Navel Orange Peel by HPLC Detection

ZHANGJuan,HUANGZhi-qiang,ZHOUPeng-hui

(Dept.ofPreventiveMedicine,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Objective: To test the effect of different extraction methods on the content of hesperidin. Method: High performance liquid chromatography was used for the determination of the content of hesperidin in Gannan navel orange peel which was respectively extracted by condensation reflux and alkali extraction. Chromatographic separation was performed by using C18 column with methanol and 0.5% acetic acid(V/V,32∶68) as mobile phase at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The UV detection wavelength was fixed at 283 nm.External calibration method was used in this experiment. Result: The linearity was obtained over the range of 10～30 mg·L-1(R=0.993 4). The content of hesperidin extracted with reflux method was 4.18 %, and was only 1.18 % with alkali extraction method . Conclusion: The content of hesperidin is higher and purer by the method of condensation reflux than alkali extraction.

high performance liquid chromatography(HPLC); hesperidin；condensation reflux; alkali extraction

江西省教育厅科技项目(NO:GJJ14698)

R285.5

A

1001-5779(2016)06-0861-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.007

2016-04-07)(责任编辑：敖慧斌)