两种增加骨密度功能保健食品的功效研究

张露勇，刘 婷，刘师卜

·临床医学· ·论著·

两种增加骨密度功能保健食品的功效研究

张露勇，刘 婷，刘师卜

目的 对2种以碳酸钙、氨基酸葡萄糖、硫酸软骨素为主要组分但不同配比的增加骨密度类保健食品的功效进行验证，从配方角度进行分析评价。方法 采用相当于人体推荐剂量的5、10、30倍浓度分别将氨糖软骨素片(0.33、0.67、2.00 g/kg)及骨密度强化胶囊(0.25、0.5、1.5 g/kg)掺入饲料给予大鼠90 d，同时分别设置与30倍剂量组钙含量相同的碳酸钙对照组。 测定大鼠体质量、股骨质量、股骨密度及股骨钙含量等指标，对比配方及结果进行分析和讨论。结果 股骨质量，增加骨密度胶囊10、30倍剂量组与碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。氨糖软骨素片30倍剂量组与碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)；股骨中点骨密度，增加骨密度胶囊30倍剂量组与碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。氨糖软骨素片30倍剂量组与碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)；股骨远心端骨密度，增加骨密度胶囊10、30倍剂量组与相应碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。氨糖软骨素片10、30倍剂量组与相应碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)；股骨钙含量，增加骨密度胶囊30倍剂量组与相应碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。氨糖软骨素片10倍、30倍剂量组与30倍碳酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)； 饲料钙含量，低钙饲料实测钙含量为1.2 mg/g。结论 2种配方的保健食品均具有增加骨密度功效，氨糖软骨素片较增加骨密度胶囊配方更合理。

保健食品；骨密度；氨基葡萄糖；硫酸软骨素

增加骨密度功能食品是市场需求较大的一类保健食品，其中以补钙为主类别产品的配方较常见的即为钙剂配合氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素进行组方。氨基葡萄糖是一类广泛存在于人和动物软骨、肌腱和韧带中的天然氨基葡聚糖，同时也是构成关节软骨的主要成分[1-2]，硫酸软骨能够预防和改善骨关节病，对受损的软骨组织进行修复[3]。因其潜在的医药价值，2010 年《中华人民共和国药典》将其列为防治心血管疾病和关节病的最佳药物。同时硫酸软骨素作为膳食补充剂和保湿剂，广泛应用于食品和化妆品领域[4-5]。市面上含这类组分的增加骨密度功能保健食品较多，但从配方角度研究评价的较少。本实验对2种配方的增加骨密度功能产品的效果进行研究，同时对效果进行对比，旨在为补钙类产品的配方评价提供新的思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 受试物

增加骨密度胶囊(简称胶囊)500 g，含氨基葡萄糖盐酸盐230 g、碳酸钙180 g、硫酸软骨素80 g，其他辅料10 g。氨糖软骨素片(简称氨糖)1 000 g，含氨基葡萄糖盐酸盐400 g、碳酸钙300 g、硫酸软骨素135 g，其他辅料165 g。本实验中所用胶囊为内容物原料，氨糖为原料干粉。简称仅代表名称，试验中给药均为干粉掺入饲料无剂型差异。

1.2 动物及饲养环境

SPF级SD种大鼠，共50只，雌性，每组10只，体质量60～75 g，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2014-0013，由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供，实验方案经中国食品药品检定研究院动物伦理委员会批准。大鼠按性别每笼1只，在实验动物室饲养观察3 d后用于试验。实验动物室为屏障环境，全密闭状态，3级过滤送风，温度22～24 ℃，相对湿度40%～60%，日光灯12 h照明，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2011-0008。高压灭菌木刨花屑为垫料。基础饲料及低钙饲料均由北京科澳协力饲料有限公司提供，饲料生产企业审查合格证号：京饲审(2009)06166。本院实验动物室提供纯化水自由饮用。

1.3 仪器和试剂

原子吸收分光光度计、骨密度仪(单光子骨密度仪或双能X线骨密度仪或相关仪器)、精密卡尺、动物解剖器械、动物天平、105 ℃烘箱。

硝酸(优级纯)、高氯酸(优级纯)、2%氧化镧溶液、钙标准溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 饲料配制 (1)低钙基础饲料配方：参照《保健食品检验与评价技术规范》2003年版第111页。(2)用低钙基础饲料配制各剂量组：剂量组按1.4.2剂量设计扩大10倍剂掺入。粉末内容物送北京科澳协力饲料有限公司，采取先高后低，由少到多逐步加入，逐级稀释的顺序掺入低钙大鼠饲料中，分别制作高、中、低、碳酸钙对照组4个剂量的饲料各20 kg。

1.4.2 剂量分组及受试样品给予途径 实验设9个剂量组，骨密度30倍剂量组1.5 g/kg(人用推荐量30倍)，10倍剂量组0.5 g/kg(人用推荐量10倍)，5倍剂量组0.25 g/kg(人用推荐量5倍)，碳酸钙对照组(与胶囊30倍钙水平相同)。氨糖剂量组2.00 g/kg为(人用推荐量30倍)，10倍剂量组0.67 g/kg(人用推荐量10倍)，5倍剂量组0.33 g/kg(人用推荐量5倍)，碳酸钙对照组(与氨糖30倍钙水平相同)。同时设一个低钙对照组(钙含量1.5 g/kg饲料)，经口给予受试样品3个月，并记录每只动物的体质量及饲料摄入量。

1.5 实验方法

1.5.1 体质量测定 禁食12 h后，测定体质量。每周1次。

1.5.2 股骨重量测定 动物喂养3个月后处死，剥离出右侧股骨，于105 ℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重。

1.5.3 骨钙含量及饲料含钙量测定 按原子吸收分光光度法测定。(1)样品采集与制备：饲料样品经均匀混合并过20目筛，在烘箱中烘干，置干燥器中冷却后称重，磨细。取大鼠一侧股骨在105 ℃烘箱中烘干至恒重后，置于三角瓶中进行消化。(2)样品消化：精确称取均匀干试样0.3～0.4 g(根据标准曲线浓度确定)于消解罐中，加混合酸消化液(硝酸：双氧水=6∶1)7 ml，于加热器内加热消化0.5 h，100 ℃，然后置于微波消解仪内消解约1 h，再在加热器内赶酸约3 h。待消解罐内液体接近2 ml时，取下冷却。用2%氧化镧溶液洗并转移至50 ml刻度离心管内，并定容至刻度。取与消化试样相同量的混合酸消化液，按上述操作做空试剂空白试验测定。(3)骨钙计算：样品钙含量(mg/g)=校准后浓度(mg/L)×50×稀释倍数/1 000/样品质量(g)。

表1 各组动物股骨质量(x±s)

组别动物数(只)股骨质量(g)P值(与低钙对照组比较)P值(与相应碳酸钙组比较)P值(氨糖和胶囊对应剂量组比较)低钙对照组100.3572±0.0230---骨密度碳酸钙组100.4859±0.0425P<0.05--胶囊5倍剂量组100.4155±0.0289P<0.05P<0.05-胶囊10倍剂量组100.4599±0.0594P<0.05P>0.05-胶囊30倍剂量组100.4829±0.0506P<0.05P>0.05-氨糖碳酸钙组100.5222±0.0330P<0.05--氨糖5倍剂量组100.4625±0.0588P<0.05P<0.05P<0.05氨糖10倍剂量组100.4702±0.0369P<0.05P<0.05P>0.05氨糖30倍剂量组100.5178±0.0409P<0.05P>0.05P>0.05

注：“-”表示未统计学处理

表2 各组动物股骨中点骨密度(x±s)

组别动物数(只)中点骨密度(g/cm2)P值(与低钙对照组比较)P值(与相应碳酸钙组比较)P值(氨糖和胶囊对应剂量组比较)低钙对照组100.161±0.015---骨密度碳酸钙组100.256±0.015P<0.05--胶囊5倍剂量组100.178±0.017P<0.05P<0.05-胶囊10倍剂量组100.212±0.026P<0.05P<0.05-胶囊30倍剂量组100.263±0.029P<0.05P>0.05-氨糖碳酸钙组100.276±0.017P<0.05--氨糖5倍剂量组100.235±0.021P<0.05P<0.05P<0.05氨糖10倍剂量组100.253±0.021P<0.05P<0.05P<0.05氨糖30倍剂量组100.275±0.029P<0.05P>0.05P>0.05

注：“-”表示未统计学处理

1.5.4 股骨骨密度测定 用骨密度仪(DISCOVERY WI AAL286)测量股骨中点及股骨远心端的骨密度。

1.6 统计学处理

实验数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<0.05，结论：各组均数间差异无统计学意义；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2 结果

2.1 股骨重量测定

由表1可见，各剂量组股骨质量均高于低钙对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

骨密度剂量组与相应碳酸钙组相比，5倍剂量组股骨质量低于骨密度碳酸钙组，差异有统计学意义(P<0.05)，10、30倍剂量组与碳酸钙组差异无统计学意义(P>0.05)。氨糖剂量组与相应碳酸钙组相比，5、10倍剂量组显著低于氨糖碳酸钙组，差异有统计学意义(P<0.05)，氨糖30倍剂量组与氨糖碳酸钙组无统计学意义(P>0.05)。

氨糖5倍剂量组股骨重量大于骨密度相应剂量组，2者差异有统计学意义(P<0.05)。10、30倍剂量组受试物差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 股骨骨密度测定

由表2可见，各剂量组股骨中点骨密度均高于低钙对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

胶囊剂量组与相应碳酸钙组相比，5倍、10倍剂量组低于其碳酸钙组(P<0.05)，30倍剂量组与碳酸钙组无统计学意义(P>0.05)。氨糖剂量组与相应碳酸钙组相比，5倍、10倍剂量组低于碳酸钙组，差异有统计学意义(P<0.05)，30倍剂量组与碳酸钙组无统计学差异(P>0.05)。

表3 各组动物股骨远心端骨密度(x±s)

组别动物数(只)远心端骨密度(g/cm2)P值(与低钙对照组比较)P值(与碳酸钙组比较)P值(氨糖和胶囊对应剂量组比较)低钙对照组100.117±0.022---胶囊碳酸钙组100.261±0.033P<0.05--胶囊5倍剂量组100.178±0.024P<0.05P<0.05-胶囊10倍剂量组100.234±0.036P<0.05P>0.05-胶囊30倍剂量组100.260±0.036P<0.05P>0.05-氨糖碳酸钙组100.273±0.03P<0.05--氨糖5倍剂量组100.217±0.03P<0.05P<0.05P<0.05氨糖10倍剂量组100.252±0.028P<0.05P>0.05P>0.05氨糖30倍剂量组100.276±0.02P<0.05P>0.05P>0.05

注：“-”表示未统计学处理

表4 各组动物股骨钙含量(x±s)

注：“-”表示未统计学处理

氨糖5倍和10倍剂量组中点骨密度大于胶囊度对应剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)，30倍剂量组受试物差异无统计学意义(P>0.05)。

由续表3可见，各剂量组股骨远心端骨密度均高于低钙对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

胶囊5倍剂量组低于其碳酸钙组(P<0.05)，10、30倍剂量组与碳酸钙组差异无统计学意义(P>0.05)。氨糖与相应碳酸钙组相比，5倍剂量组低于碳酸钙组(P<0.05)，10倍、30倍剂量组与碳酸钙组差异无统计学意义(P>0.05)。

氨糖5倍剂量组远端骨密度大于胶囊相应剂量组(P<0.05)，10倍、30倍剂量组受试物差异无统计意义(P>0.05)。

2.3 股骨钙含量

由表4可见，除胶囊5倍剂量组骨钙含量与低钙对照组差异无统计学意义(P>0.05)，其他各组骨钙含量均高于低钙对照组，其中胶囊10倍剂量组为差异有统计学意义(P<0.05)，其他各组差异均有统计学意义(P<0.05)。

胶囊5倍、10倍剂量组骨钙含量低于其碳酸钙组(P<0.05)，30倍剂量组与碳酸钙组无统计学差异(P>0.05)。氨糖5倍剂量组骨钙含量低于碳酸钙组(P<0.05)，10倍、30倍剂量组与碳酸钙组差异无统计学意义(P>0.05)。

氨糖5倍剂量组骨钙含量、10倍组骨钙含量均大于胶囊相应剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，30倍剂量组2受剂型差异无统计意义(P>0.05)。

2.4 饲料钙含量

低钙饲料设计钙含量为1.5 mg/g，实测含量为1.2 mg/g。每种饲料均在不同部位取3点，计算后取均值。

表5可见所有组别饲料的钙含量实测值与用低钙饲料计算所得的设计值都很接近，证明饲料加工工艺良好。

表5 实测饲料钙含量(x±s)

组别取样点编号取样饲料钙含量(mg/g)实测3点平均钙含量(mg/g)以低钙饲料1.2mg/g计算饲料理论钙含量氨糖30倍剂量组15.3455.3604.16725.30735.427氨糖10倍剂量组12.8063.0952.18223.28733.191氨糖5倍剂量组11.8781.8831.65721.91431.858氨糖碳酸钙组13.9633.9544.16723.99433.905胶囊30倍剂量组13.7123.5833.87523.52933.508胶囊10倍剂量组12.0542.0482.07722.04632.045胶囊5倍剂量组11.4731.4961.62721.47731.538胶囊碳酸钙组14.0153.9703.87523.99633.899低钙组对照组11.2221.203/21.17931.208

表6 实验大鼠钙总摄入量(g，x±s，n=10)

组别胶囊氨糖总进食量(g)实测钙含量(mg/g)钙总摄入量(g)总进食量(g)实测钙含量(mg/g)钙总摄入量(g)低钙对照组1481.0±109.71.2031.78±0.131481.0±109.71.20311.78±0.13碳酸钙组1567.9±168.13.9706.22±0.671591.3±119.44.30236.88±0.725倍剂量组1528.8±107.81.4962.29±0.161472.2±189.31.88332.77±0.3610倍剂量组1457.5±178.32.0482.99±0.371329.0±66.833.09464.11±0.2130倍剂量组1520.6±166.13.5825.45±0.601441.5±165.24.27316.16±0.71

表7 2种样品各组分日用推荐量(mg/d)

样品氨基葡萄糖盐酸盐碳酸钙离子钙(碳酸钙折算)硫酸软骨素其他辅料氨糖16001200480540640胶囊13801080432480600

2.5 2种增加骨密度功能保健食品评价

增加骨密度胶囊和氨糖软骨素片均具有增加骨密度功能；结合股骨重量、股骨中点及远心端骨密度、骨钙含量3项指标，提示氨糖软骨素片的增加骨密度功效优于增加骨密度胶囊，与两受试物人用推荐量一致，具有剂量效应关系。

3 讨论

低钙饲料实测钙含量为1.2 mg/g低于1.5 mg/g的设计值，以此低钙饲料为基础饲料配置2种受试物高、中、低3种浓度的掺入饲料，依照配方可计算出设计钙含量。比对实测值，可见设计浓度与实测浓度非常接近，证明饲料加工工艺良好。由表2～5结果可见无论是股骨重量、股骨中点及远心端骨密度还是骨钙含量这些指标，低钙对照组均低于其他组别，证明低钙模型成立。根据2010年国标规定大鼠生长繁育饲料钙含量为10～18 mg/g[6]。通过表6可以看到即使是30倍剂量的钙含量都远未达到正常饲料的含钙量，在钙量不足前提下2个产品均表现出了良好的增加骨密度功效，提示2个受试物均具有提高钙吸收和利用功效。

由以上结果可见，同为5倍推荐剂量时，氨糖软骨素片效果优于增加骨密度胶囊。但推荐剂量增至10倍或更高时，两者各项指标并无明显差别。提示增加骨密度胶囊的因其日用推荐量的钙离子偏低，即使在5倍剂量浓度下钙离子仍未满足大鼠正常生理需求。而10倍以上剂量时，钙离子达到了大鼠生理需求的“饱和”状态，因此与氨糖软骨素片效果比较无统计学意义。虽然这2个产品是以补钙为主的增加骨密度类保健食品，但更希望看到复方产品在促进钙剂吸收及利用方面发挥作用，而不仅仅做为是“钙片”使用。毕竟在正常饮食条件下钙摄入缺乏的情况已经很少出现。2个受试物在总钙量均未达到大鼠钙生理需求的“饱和”状态下，效果差异并不能说明谁的日用推荐量更合理，因为这时起决定性作用的是总钙用量。

因本实验的初衷并非对两配方，因此没有设置受试物相同钙摄入量组进行对比。但由于剂量设计和饲料加工的原因，最终结果显示仍可以对两配方的合理性进行比较。由表4、5可见氨糖软骨素片5倍组饲料实测饲料钙含量为1.883 mg/g，实际钙总摄入量为2.77 g；增加骨密度胶囊10倍剂量组实测饲料钙含量为2.048 mg/g，实际钙总摄入量为2.99 g。对比2个剂量组各项指标。股骨中点骨密度，氨糖软骨素片大于骨密度，差异有统计学意义。氨糖软骨素片在实际饲料钙含量及总钙摄入量均低于骨密度胶囊的前提下，仍有一项指标优于骨密度。据此可以推断氨糖软骨素片的配比优于增加骨密度胶囊。

本次验证的2个配方主要组分均为碳酸钙、氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素。配比依照顺序氨糖软骨素片为1∶1.33∶0.45，增加骨密度胶囊为1∶1.28∶0.44。可以看到氨糖软骨素片与增加骨密度胶囊配比的最大区别在于氨基葡萄糖盐酸盐的含量更高。

氨基葡萄糖盐酸盐是一种天然的氨基单糖，甲壳素类物质。是软骨基质和滑液中聚氨基葡萄糖的成分。可抑制因免疫而造成的蛋白多糖降解、外源性的氨基葡萄糖还可以刺激软骨细胞合成蛋白多糖[7]。补充软骨基质丢失的成分，通过抑制基质金属蛋白酶的表达，从而促进软骨的修复[8]。在补钙功效保健食品中主要发挥螯合剂作用，使产品具有良好的生物和化学稳定性、提升补钙效果[9]。

硫酸软骨素(CS)是存在于人和动物的软骨、肌腱、肌膜和血管壁中的一种酸性黏多糖，主要是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基氨基半乳糖组成，根据硫酸基在半乳糖上位置不同有多种异构体，主要为硫酸软骨素A(CSA)和硫酸软骨素C (CSC)。硫酸软骨素是结缔组织的重要组成部分,具有多种药理作用。研究表明，硫酸软骨素可通过刺激软骨细胞合成蛋白聚糖、透明质酸和Ⅱ型胶原，从而促进骨细胞增生、诱导新骨形成、延缓骨衰老等作用[10]。目前临床上主要用于治疗骨关节炎，2003年欧洲风湿病防治联合会指南中推荐CS用于治疗膝关节骨关节炎[11]。硫酸软骨素具有明显的亲软骨性,可进入软骨组织,保护软骨。研究表明，硫酸软骨素能抑制关节炎大鼠基质中金属蛋白酶-9和白介素-1β的合成及水肿的产生，从而避免了软骨损害的进一步发展[12]。

由表7可见受试物日用推荐量氨糖软骨素片为4 g/d高于增加骨密度胶囊3 g/d。辅料主要为赋形剂，无功效作用。在本实验中实验设计是为了同时验证2个受试物各自是否具有增加骨密度功能。但通过前面对最终数据的分析，笔者得出一些有意义的结论。首先2个受试物均具有增加骨密度功效；因为氨糖软骨素片的日用推荐量较增加骨密度胶囊高，在用于严重缺钙对象时效果会更好。但鉴于保健食品一般作为正常饮食以外的膳食补充剂使用，严重钙缺乏的情况极少存在，因此2种产品的日用推荐量均在合理范围；氨糖软骨素片和增加骨密度胶囊分别提高一定给药浓度，氨糖软骨素片在实际钙摄入量低于骨密度胶囊前提下增加骨密度效果更好，证明氨糖软骨素片的配比更为合理，从配方角度分析主要原因是氨基葡萄糖盐酸盐的设计含量更为合理。

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(本文编辑：张阵阵)

Study on the efficacy of two kinds of functional health food for the enhancing of bone density

Zhang Luyong, Liu Ting, Liu Shibo

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China)

Objective To evaluate the efficacy of 2 kinds of functional health food for the enhancing of bone density with calcium carbonate, glucosamine and chondroitin sulfate as the main components but with different concentrations, and also to analyze their different formulae.MethodsThe rats were fed with the animal feed mixed with glucosamine chondroitin tablets with the concentration levels of 5, 10 and 30 times of the recommended human doses (i.e. at the dosages of 0.33 g/kg, 0.67 g/kg and 2.00 g/kg) and bone density-enhancing capsules (with dosages of 0.25 g/kg, 0.5 g/kg and 1.5 g/kg) for as long as 90 days. At the same time, the group of the animals given calcium carbonate with the concentration level as high as 30 times was set as the control group. Body weight, femur weight, femur bone density and calcium content and other indicators of the rats were detected, and then, analyses and discussions were made against the formulae and the detection results.ResultsStudy results indicated that there were no differences in femur bone weight for those animal groups of 10-time and 30-time bone density-enhancing capsules, as compared with that of the calcium carbonate group or the control group(P>0.05). There was also no difference for the 30-time dosage group of glucosamine chondroitin tablets, when compared with the calcium carbonate group(P>0.05). There were no differences in mid femur bone density for the animal group of 30-time bone density-enhancing capsules, as compared with that of the calcium carbonate group(P>0.05)There was also no difference for the 30-time dosage group of glucosamine chondroitin tablets, when compared with the calcium carbonate group(P>0.05). There were no differences in distal femur bone density for those animal groups of 10-time and 30-time bone density-enhancing capsules, as compared with that of the calcium carbonate group(P>0.05). There were no differences for the 10-time and 30-time dosage groups of glucosamine chondroitin tablets, when compared with the calcium carbonate group(P>0.05). No differences could be seen in femur calcium content for the 30-time bone density-enhancing capsule group, when compared with the calcium carbonate group(P>0.05). Neither differences could be noted for the 10-time and 30-time dosage groups of glucosamine chondroitin tablets, when compared with the 30-time calcium carbonate group(P>0.05). As for the calcium content in the feed, the actual measured calcium content in the low calcium feed was 1.2 mg/g.ConclusionThe health food of the 2 formulae all had the function to increase bone density, and the glucosamine chondroitin tablets were more superior to the bone density-enhancing capsules.

Health food; Bone density; Glucosamine; Chondroitin sulfate

100050 北京，中国食品药品检定研究院

R285

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2016.06.014

2016-03-28)