hsa-miR-759促进胃癌细胞SGC-7901增殖的机制研究

储著凌，侯乐伟，胡国强，胡 君，尹 鹏，朱 清

·临床医学· ·短篇论著·

hsa-miR-759促进胃癌细胞SGC-7901增殖的机制研究

储著凌，侯乐伟，胡国强，胡 君，尹 鹏，朱 清

NGX6；SGC-7901；hsa-miR-759；增殖活性

世界范围内，胃癌发病率在所有恶性肿瘤中居第4位，其致死率则位于第2位，我国是胃癌高发国家，每年新增病例约占全球新增数量的40%。由于我国早期胃癌诊断率较低，治疗方法多以手术切除为主，这使得胃癌的致死率高于世界平均水平，因此，寻找胃癌诊断的新方法以及治疗的新途径尤为重要[1]。目前，早期胃癌临床治疗多以手术为主，内镜下黏膜切除术(EMR)和内镜下黏膜下剥离术(ESD)是主要的2种手术方法[2-3]。临床原发肿瘤的切除，通常对于肠型黏膜内癌，病灶部位无溃疡或溃疡疤痕的胃癌有较好的效果，而对伴有远处转移的胃癌多数是无法治愈的。对于进展期或复发性的肿瘤，化疗的作用有限，即使联用放疗也难以达到治愈。因此，寻找潜在的胃癌基因治疗靶点，对胃癌的深度和彻底治疗尤为重要。NGX6基因位于人基因组的9号染色体[4]，相关研究表明，NGX6具有明显的肿瘤抑制作用[5]。那么，NGX6在胃癌的发生机发展中是否具有关键的作用，NGX6在胃癌中表达异常的原因是什么，NGX6蛋白表达上调是否对胃癌具有抑制作用？为了阐明上述问题，笔者将在胃癌细胞株SGC-7901中展开相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌及其癌旁组织取自解放军第四五四医院，SGC-7901细胞株，293工具细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，DMEM(Dulbecco minimum essential medium)高糖细胞培养基、0.25 %胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Lipofectamine 3000转染试剂购于Invitrogen公司产品，荧光素酶报告基因表达载体(PGL3-promoter)和荧光素酶检测系统购于Promega公司，RNA提取试剂盒及M-MLV反转录试剂盒为大连宝生物功臣有限公司产品，NGX6蛋白一抗及二抗均为美国Santacruz公司产品，细胞及组织总蛋白提取及定量试剂盒、化学发光试剂盒均为美国Pierce公司产品，miRNA合成、测序均在上海生工工程有限公司完成，MTT(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide ，DMSO)为Sigma公司产品，无内毒素质粒DNA提取试剂盒为Qiagen公司产品，荧光定量检测试剂盒、限制性内切酶，连接酶均为Takara公司产品。

1.2 仪器和设备

细胞培养箱购于美国Thermo公司，微量移液器、水平离心机、高速低温离心机均为Eppendorf公司产品，转膜仪、垂直电泳槽及电泳仪为上海天能公司产品，紫外分光光度检测仪与酶标仪购于Thermo公司，PCR仪为美国ABI公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 胃癌标本中hsa-miR-759及NGX6蛋白含量检测 收集贲门癌及其癌旁组织5对，生理盐水漂洗后经滤纸吸干水分，将组织装入2.0 ml细胞冻存管，编号后液氮保存。实验前，取出液氮保存的组织样本，切取约200 mg，加入1 ml Trizol，后进行组织匀浆并将匀浆液4℃下12 000×离心2 min，收集上清，然后酚氯仿法提取组织Total RNA。取2 μg RNA经M-MLV反转录制备cDNA，荧光定量法检测组织中hsa-miR-759含量。另取相同大小组织，加入1 ml组织裂解液T-MER，经充分匀浆后进行组织蛋白提取和定量，实验过程完全按照试剂盒说明书进行，蛋白提取完成之后，通过免疫印迹法检测组织中NGX6蛋白相对含量。

1.3.2 生物信息学预测hsa-miR-759与NGX6 3′-UTR结合位点 采用Targetscan预测软件对NGX6(NM_016446) 3′-UTR区与hsa-miR-759进行结合位点预测，预测结果显示(图2A)，hsa-miR-759在NGX6的3′-UTR区存在7个碱基的种子区“5′-CACUCUG-3′”。

1.3.3 载体构建 设计合成长链DNA，5′-CTAGACCUCCAGCTGTTCCACACTCTGTCCUCCAGCTGTT CCACACTCTGTT-3′，下游引物，5′-CTAGAACAGAGTGTGGAACAGCTGGAGGACAGAGTGTGGAA CAGCTGGAGGT-3′，2端分别添加XbaⅠ酶切位点，片段包含hsa-miR-759与NGX6基因3′UTR区结合位点，长链退火形成双链DNA，后克隆至荧光素酶报告基因表达载体PGL3-promoter，重组载体命名为野生型荧光素酶报告基因表达载体pGL3-WT-NGX6，同样的方法，将预测结合位点进行错义突变，即由“5′-CACTCTG-3′”突变为“5′- TGCTCAC -3′”，构建野生型荧光素酶报告基因表达载体pGL3-MT-NGX6。重组载体经序列分析无误后，扩增转化其对应的转化细菌，然后进行无内毒素质粒DNA制备，提取过程严格按照试剂盒说明进行，使用ddH2O将质粒DNA终浓度调整至500 mg/L,-20℃保存。

1.3.4 双荧光素酶报告基因法验证has-hsa-miR-759与NGX6靶位关系 化学法合成hsa-miR-759 mimics(5′- CAGUUUUAACAAACGUGAGACGtt -3′)，hsa-miR-759 inhibitor(5′- CGUCUCACGUUUGUUAAAACUGtt -3′)和hsa-miR-759 NC(5′- AACUUAGGAACGU GUCGACAUAtt -3′),RNA通过3′末端降解。接种对数期的293细胞至24孔培养板，每孔500 μl细胞悬液(1×105个细胞)，培养基使用含10%FBS的DMEM完全培养基，37℃和5% CO2条件下培养24 h，参照Lipofectmaine 3000转染试剂说明书进行质粒和RNA共转染实验。实验分为9组：细胞对照组(不做处理)，pGL3-WT-NGX6转染组，pGL3-MT-NGX6转染组, miRNA125-NC+pGL3-WT-NGX6转染组，miRNA125-NC+ pGL3-MT-NGX6转染组, hsa-miR-759-mimics+pGL3-WT- NGX6转染组，hsa-miR-759-mimics+pGL3-MT- NGX6，hsa-miR-759-inhibitor+pGL3-WT- NGX6转染组和hsa-miR-759-inhibitor+pGL3-MT- NGX6转染组。细胞转染后48 h，收集细胞，检测胞内荧光素酶活性。

1.3.5 转染hsa-miR-759-mimics/inhibitor对SGC-7901细胞hsa-miR-759含量及NGX6蛋白表达的影响检测 接种对数生长期的SGC-7901细胞至6孔细胞培养板，每孔添加2 mL细胞悬液(5×105个细胞)，使用含10%FBS的DMEM完全培养基，正常条件过夜培养，然后进行转染实验，转染过程及RNA用量完全参照试剂盒Lipofectmaine 2000说明书。实验分为4组，细胞对照组，hsa-miR-759 NC转染组，hsa-miR-759 mimics转染组和hsa-miR-759 inhibitor转染组。转染后48 h，收集细胞，提取细胞Total RNA，荧光定量法检测hsa-miR-759含量，同时，提取细胞总蛋白，免疫印迹法检测胞内NGX6蛋白表达状况。

1.3.6 SGC-7901细胞增殖活性的检测 实验分为4组，细胞对照组、NC转染组、hsa-miR-759 mimics转染组和hsa-miR-759 inhibitor转染组。取转染后48 h的SGC-7901细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10 %FBS的DMEM完全培养基调整细胞密度至1×105个/ml，并接种细胞到96孔细胞培养板，每孔添加100 μl细胞悬液，37℃和5% CO2条件下培养细胞，在接种后24、48和72 h，MTT法检测细胞活性。检测前，每孔细胞加入MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，轻晃使其分布均匀，正常条件继续培养4 h，去上清，每孔加入150 μl DMSO溶液，37℃放置15 min，酶标仪检测490 nm波长下细胞液的吸光度值，制作细胞生长曲线。

1.3.7 Realtime-PCR检测hsa-miR-759含量 取2 μg的细胞总RNA，反转录制备cDNA，特异反转录引物：H.sapiens 6 snRNA: 5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′，hsa-miR-759: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAGTCAA-3′，取2 μl反转录产物作为PCR反应模板，SYBR Premix ExTaq10 μl，引物(10 μmol/L)各取0.25 μl，反应体系用dH2O补足至20 μl。PCR反应条件：95℃ 10 s；55℃ 10 s；72 ℃ 10 s，反应循环数为42。PCR引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGC AGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGC TTAAAC-3′；hsa-miR-759上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游引物5′- GCAGAGTGCAAACAATTTTGAC-3′。结果分析中，以U6作为对照，ΔΔCt法分析定量结果。

1.3.8 Western blotting检测NGX6蛋白相对含量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为11%，蛋白上样量为10 μg，然后经110 V电压90 min电泳，400 mA恒定电流转膜90 min，转膜后以5%的脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃一抗过夜孵育，NGX6和GAPDH一抗稀释(TBST)比分别为1︰300和1︰1 000；一抗过夜孵育后，TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀释比为1︰2 000；TBST洗膜3次，添加ECL化学发光液反应底物，曝光X底片，最后对目的条带光密度值进行分析。

1.4 统计学处理

所有数值都用均数±标准差(x±s)表示。细胞增殖的数据通过方差分析和两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义，所有分析均以SPSS 13.0统计软件完成。

2 结果

2.1 胃癌标本中hsa-miR-759与NGX6蛋白含量检测

相比较于癌旁组织，胃癌组织中的hsa-miR-759含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图1A)；NGX6蛋白含量检测结果(图2B)显示，胃癌组织和癌旁组织中蛋白含量分别为(1.00±0.16)和(4.31±0.85)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与肿瘤组织比较aP<0.05。A为miR-759含量，B为NGX6蛋白含量电泳图和蛋白表达水平图1 肿瘤标本中hsa-miR-759与NGX6蛋白含量检测

2.2 hsa-miR-759与NGX6靶位关系验证

生物信息学预测显示，miR-759在NGX6基因3′UTR区有6个碱基的结合位点(图2A)。细胞共转染后48 h，荧光素酶相对活性检测结果显示(图2B)，hsa-miR-759 mimics能够明显抑制野生型荧光素酶表达载体荧光素酶活性，从5.51±0.68降至1.82±0.39，差异具有统计学意义(P<0.05)，而hsa-miR-759 inhibitor则能够增强野生型荧光素酶报告基因表达载体的荧光素酶活性，5.51±0.68上升至10.02±0.49，组间差异有统计学意义(P<0.05)；对于突变型荧光素酶报告基因表达载体，无论hsa-miR-759 mimics或者hsa-miR-759 inhibitor都对其无明显影响。以上数据和结果说明，hsa-miR-759可以通过预测靶位结合于NGX6基因3′UTR区，并对基因表达进行负调控。

2.3 SGC-7901细胞转染后hsa-miR-759含量及NGX6蛋白表达检测

SGC-7901细胞转染hsa-miR-759-mimics或者inhibitor后48 h，细胞内hsa-miR-759含量明显升高或者降低(图3A)，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而hsa-miR-759-NC转染组hsa-miR-759含量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；蛋白含量检测结果说明(图3B)，SGC-7901细胞转染hsa-miR-759-mimics或者inhibitor后48 h，细胞内NGX6含量明显降低或者升高，与细胞对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而hsa-miR-759-NC转染组NGX6蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与对照组比较aP<0.05。A为各组miR-759含量，B为各组NGX6蛋白含量电泳图和蛋白表达水平图3 转染后SGC-7901细胞内hsa-miR-759及NGX6蛋白含量检测

2.4 hsa-miR-759含量变化对SGC-7901细胞增殖活性的影响

细胞活性检测结果(图4)所示，转染后48 h和72 h，与转染对照组比较，hsa-miR-759 mimics转染组细胞增殖活性则明显增强，hsa-miR-759 inhibitor转染组SGC-7901细胞增值活性明显降低(P<0.05 vs 对照组，相同时间点)，NC转染组细胞增殖活性与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

微小RNA(micro RNA, miRNA) 属于内源性非编码RNA，可以通过种子区与其靶基因3′-UTR区结合，从而抑制基因翻译[3]。miRNA与肿瘤关系密切，作为癌基因和肿瘤抑制基因，参与关键的发病机制[6-7]。miRNA-483-3p和miRNA-21在胰腺导管癌患者血清中的含量明显升高，miRNA-483-3p可以作为管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)患者和胰腺导管腺癌的血浆样品(PDAC)患者的区分标志物，而miRNA21则可以作为PDAC患者预后标志物[8]。miR-34c被发现可以对乳腺癌的细胞周期产生调控作用[9]。前列腺的相关研究表明，miR-23a的下调，会导致MAPK、JAK/STAT等肿瘤调控通路的过度激活，进而导致细胞增殖的失控，体外研究表明，miR-23a有作为胰腺癌基因治疗的潜在靶点[10]。这些研究表明，miRNAs调控机制的失活，是多种肿瘤发生发展的内在因素和始作俑者，因此其完全具有成为肿瘤基因治疗靶点的可能。miRNA与胃癌亦具有密切的关系，miR-144-zfx调控轴在胃癌恶性病变中具有关键作用[11]，miR-107有潜力作为胃癌患者胃癌肿瘤缺氧检测的生物标志物[12]，而mir-367被证实是胃癌的侵袭和转移的一个关键的负调控因子[13]。与胃癌相关的miRNA研究表明，miRNA在胃癌细胞的增殖，分化和凋亡中具有关键作用，是胃癌的发生、侵袭和转移的重要调控因子[13]。

NGX6基因位于染色体9号染色体的q21-22区域[4]，研究表明在多种肿瘤中存在其等位基因的事实[5]。Guo Q等研究发现，NGX6与胃癌的发病率和死亡率密切相关，NGX6可以作为种新型的肿瘤抑制基因，过表达基因可以抑制人体胃癌细胞株HT-29的侵袭，NGX6的这种肿瘤抑制作用可能与Wnt通路的激活抑制有关[14-15]。NGX6具有多种生物学功能，如调节相关基因的蛋白表达，涉及细胞信号转导通路，负调控细胞周期，抑制血管生成，增加患者对抗癌药物的敏感性。有研究表明，NGX6通过组蛋白H3K9负调控核转录因子SP1的启动子甲基化，进而影响其作为转录因子的功能，NGX6可以作为恶性肿瘤的潜在靶基因，具有极大的应用研究价值[16-17]。

在胃癌组织中验证NGX6的表达，数据显示NGX6在胃癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，对胃癌组织中NGX6蛋白低表达的原因做了研究，生物信息学显示，hsa-miR-759可能靶向调控NGX6，那么在胃癌中hsa-miR-759的表达情况是否也具有异常呢。荧光定量检测结果显示，胃癌组织中hsa-miR-759的含量显著高于癌旁组织，hsa-miR-759 与NGX6在胃癌中的表达具有显著的负相关性。那么hsa-miR-759在胃癌中的高表达是否导致NGX6表达降低，是否是胃癌的发生、发展的关键因素，无疑是一个值得研究的课题。

Hsa-miR-759定位于人13号染色体，截止目前，未见有关于其与肿瘤或者胃癌的相关报道。首先对hsa-miR-759与NGX6蛋白表达相关性做出分析，在二者具有显著负相关性的基础上，通过生物信息学对二者结合位点做了分析，并通过荧光素酶报告基因实验进行了验证。hsa-miR-759在胃癌中的高表达导致了肿瘤组织内NGX6表达的显著降低，通过基因干预的方式，改变了细胞内hsa-miR-759的含量，并且对SGC-7901细胞的增殖活性产生了明显影响，这组数据是令人鼓舞的，通过转染miR-759-inhibitor到SGC-7901细胞，明显抑制了细胞内hsa-miR-759相对含量，增强了细胞内NGX6蛋白含量，同时抑制了肿瘤细胞的增殖活性。所有数据说明，miR-759-inhibitor通过抑制SGC-7901细胞内hsa-miR-759，增强了靶蛋白NGX6表达，而高表达的NGX6则明显抑制了SGC-7901细胞的增殖活性。

本研究的意义在于，首次证实hsa-miR-759-inhibitor可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖活性，且这种作用是通过上调其靶蛋白NGX6来实现的。这提示，hsa-miR-759有潜力成为基因治疗的新靶点。

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(本文编辑：张阵阵)

210002 南京，解放军第四五四医院普外科(储著凌、侯乐伟、胡国强、胡君、尹鹏)，消化科(朱清)

朱清，电子信箱：luyican321@163.com

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10.3969/j.issn.1009-0754.2016.06.021

2015-12-24)