盐酸沙格雷酯片微生物限度检查方法的建立

张文燕，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

药品质量与检验

盐酸沙格雷酯片微生物限度检查方法的建立

张文燕，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：建立盐酸沙格雷酯片的微生物限度检查方法。方法：采用带过滤功能均质袋对样品进行粗滤，取粗滤后的供试溶液采用薄膜过滤法进行计数检查，采用未经粗滤处理的供试液常规薄膜过滤法进行控制菌检查。结果：该方法的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查适用性试验均符合《中国药典》2015年版的要求。结论：该法可用于盐酸沙格雷酯片微生物限度需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。

盐酸沙格雷酯片，微生物限度检查，样品粗滤，薄膜过滤法

盐酸沙格雷酯片是口服固体给药制剂，主要作用是改善慢性动脉闭塞症所引起的溃疡、疼痛以及冷感等缺血性诸症状。本品有一定的抑菌作用。执行2010年版[2]时用500 r/min离心3 min，去除药渣消除抑菌作用，取上清液以常规薄膜过滤法进行微生物限度检查。和《中国药典》2010年版微生物限度检查方法相比，2015年版[1]有重大增修订，如取消了500 r/min离心3 min处理的方法，这对于原采用此方法去除药渣，进而消除抑菌成分的品种的微生物限度检查带来了挑战，对检查方法的建立带来一定的困难。本文尝试采用带过滤功能均质袋对样品进行粗滤，取粗滤后的供试液，采用薄膜过滤法进行盐酸沙格雷酯片的微生物限度检查，并按照《中国药典》2015年版四部通则的要求进行方法适用性试验，同时指出新版微生物限度检查法进行日常检测时所需注意的问题，旨在为检测机构和药品生产厂家提供参考，为《中国药典》2015 年版的顺利实施提供参考[5]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BD240 恒温培养箱(德国BINDER)；SG-403A TX-INT生物安全柜(美国Baker)；SQP 精密电子天平(德国赛多利斯)；Lab dancer 漩涡混合器(德国IKA)；Yamato 810C 高压灭菌锅(日本Yamato株式会社)；SHAKE4000-8CE摇床 (美国Thermo)；薄膜过滤器(英国Whatman公司)；带过滤功能均质袋(上新牌，过滤网孔径<50 μm，规格30 cm×19 cm)；AESAP1069拍打仪(法国梅里埃)。

1.2 试验菌种 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus,CMCC (B)26003]，枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis,CMCC(B)63501]，铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa,CMCC(B)10104]，白色念珠菌[Candida albicans,CMCC (F) 98001]，黑曲霉[Aspergillus niger,CMCC (F)98003]，大肠埃希菌[Escherichia coli，CMCC(B) 44102]均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 培养基及稀释剂 胰酪大豆胨琼脂培养基(批号 151202)、胰酪大豆胨液体培养基(批号 151027)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号 151106)、麦康凯液体培养基(批号 151204)、麦康凯琼脂培养基(批号 151124)均购自北京陆桥技术有限责任公司；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号 1404112)购自中国食品药品检定研究院。以上市售脱水培养基均按标签说明配制并高压灭菌后备用。

1.4 试验药品 盐酸沙格雷酯片(某公司生产，规格为100 mg/片，批号150401) 。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种至10 ml胰酪大豆胨液体培养基中，32.5 ℃培养24 h；取白色念珠菌的新鲜培养物，接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，22.5 ℃培养72 h。取上述四种菌的新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基(培养基约25 ml，试管内径为25 mm)中，22.5 ℃培养7 d后，加入4 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80 的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

2.2 供试液制备 取本品10 g至无菌三角瓶中，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，振摇使分散均匀，作为1∶10的供试液。取1∶10供试液20 ml，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，制成1∶50供试液。以上各供试液分别平行制备6份。

2.3 计数方法适用性试验

2.3.1 比值计算 计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内[1,3,4]。公式1：试验组的比值=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液对照组的平均菌落数[1];公式2：粗滤处理后菌液组比值=粗滤处理后的平均菌落数/菌液对照组的平均菌落数。

2.3.2 1∶10和1∶50供试液平皿倾注法测定[1]

2.3.2.1 试验组 A：取1∶10供试液9.9 ml置灭菌试管中，加入适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，取1 ml注皿，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，置32.5 ℃培养箱培养48～120 h，逐日观察结果。同法制备含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供试液。B：取1∶50供试液9.9 ml置灭菌试管中，后同A法。

2.3.2.2 供试品对照组 取1∶10和1∶50供试液各1 ml注皿，后同“2.3.2.1”项下试验组A法。

2.3.2.3 菌液对照组 取适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至10 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，取1 ml注皿，后同“2.3.2.1”项下试验组A法。

2.3.2.4 结果 因本品抑菌性很强，各试验组的比值均为0，因此不能采用上述方法进行本品微生物限度计数检查。

2.3.3 1∶10和1∶50供试液薄膜过滤法测定[1]

2.3.3.1 试验组 A：取1∶10供试液9.9 ml置灭菌试管中，加入适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，取1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 ml分次冲洗，取膜贴于相应的琼脂培养基上,置32.5 ℃培养箱培养48～120 h，逐日观察结果。同法制备含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供试液。B：取1∶50供试液9.9 ml置灭菌试管中，后同A法。

2.3.3.2 供试品对照组 取1∶10和1∶50供试液各1ml薄膜过滤，后同“2.3.3.1”项下试验组A法。

2.3.3.3 菌液对照组 取适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至10 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，取1 ml薄膜过滤，后同“2.3.3.1”项下试验组A法。

2.3.3.4 结果 按“2.3.1”项下公式1计算比值，结果见表1。根据表1结果，常规1∶10供试液1 ml薄膜过滤，由于本品药渣的影响，在薄膜上无法正常计数，因此不能采取本方法进行计数试验。常规1∶50供试液1 ml薄膜过滤，虽然药渣影响减弱，但对菌落计数的影响依然存在，尤其是枯草芽孢杆菌和铜绿假单孢菌，因此不能采取本方法进行计数试验。

表1 1∶50供试液薄膜过滤法测定试验组比值

2.3.4 粗滤处理1∶10和1∶50供试液薄膜过滤法测定

2.3.4.1 试验组 A：将三角瓶中1∶10供试液100 ml中，加入适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，将该供试液全量置于带过滤功能均质器专用袋大体积一侧中，在拍打仪中充分拍打30 s。取过滤后小体积一侧的试液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 ml分次冲洗，取膜贴于相应的琼脂培养基上，置32.5 ℃培养箱培养48～120 h，逐日观察结果。同法制备含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供试液。B：将三角瓶中1∶50供试液100 ml中，加入适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，将该供试液全量置于带过滤功能均质器专用袋大体积一侧中，在拍打仪中充分拍打30 s。取过滤后小体积一侧的试液1ml薄膜过滤，后同试验组A法。

2.3.4.2 供试品对照组 取1∶10和1∶50供试液分别全量置于带过滤功能均质器专用袋大体积一侧中，在拍打仪中充分拍打30 s。取过滤后小体积一侧的试液各1 ml薄膜过滤，后同“2.3.4.1”项下试验组A法。

2.3.4.3 菌液对照组 取适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，取1 ml薄膜过滤，后同“2.3.4.1”项下试验组A法。

2.3.4.4 粗滤处理后菌液对照组 取适量浓度的0.1 ml枯草芽孢杆菌菌液加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供试液，将该供试液全量置于带过滤功能均质器专用袋大体积一侧中，在拍打仪中充分拍打30 s。取过滤后小体积一侧的试液1 ml薄膜过滤，后同“2.3.4.1”项下A法。

2.3.4.5 结果 按“2.3.1”项下公式1和公式2计算比值，结果见表2和表3。根据表2结果可以看出，带过滤功能的均质器专用袋对样品进行粗滤处理后菌液对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值在0.5～2之间，是符合《中国药典》规定的。因此，本品可以采用上述粗滤的方法进行供试液的处理。从表3可以看出，粗滤处理后的1∶10供试液1 ml进行薄膜过滤，虽然药渣影响减弱，但对菌落计数的影响依然存在，尤其是枯草芽孢杆菌和铜绿假单孢菌，而且由于药渣的残留，本品对试验菌的抑菌作用依然存在，所以不能采用此方法进行方法适用性试验。粗滤处理后1∶50供试液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 ml分5次进行冲洗，结果试验组菌数与菌液对照组菌数的比值均在0.5～2之间，因此，盐酸沙格雷酯片微生物限度需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查可采用此法。

表2 粗滤处理后菌液对照组回收率比值(n=3)

2.4 控制菌方法适用性试验 盐酸沙格雷酯片为口服固体制剂，控制菌检查大肠埃希菌。在之前按照《中国药典》2010年版二部附录[2]进行检测的时候，采用的方法为：取本品10 g，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10供试液。取1∶10供试液适量，置离心管中，以500 r/min离心3 min后，取全部上清液10 ml，薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 ml分次冲洗，在最后一次冲洗液中加入规定量大肠埃希菌(约10～100 cfu)后过滤，取滤膜加入到500 ml胆盐乳糖培养基中，依法检查。因此，尝试新的方法进行控制菌检查法的方法适用性试验。

2.4.1 供试液制备 同“2.2”项下供试液制备。

2.4.2 菌液制备 取大肠埃希菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，32.5 ℃培养24 h。取上述大肠埃希菌的新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。2.4.3 方法适用性试验 曾尝试取1∶10的供试液10 ml薄膜过滤，因药渣残留太多，根本无法过滤下去，因此采用分两张滤膜过滤，每膜5 ml，加入规定量试验菌(不大于100 cfu)，取两滤膜置500 ml和800 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，试验组均未有菌落生长。因此不能采用上述方法进行检查。①试验组：取1∶10的供试液10 ml薄膜过滤，分两张滤膜过滤，每膜5 ml，加入规定量试验菌(不大于100 cfu)，取两滤膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。②阳性对照组：取规定量大肠埃希菌(不大于100 cfu)，加入1 000 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，32.5 ℃培养18 h。③阴性对照组：取10 ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液同试验组操作。取试验组、阳性对照组上述培养物各1 ml接种至100 ml麦康凯液体培养基中，43 ℃培养24 h。取上述麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上， 32.5 ℃培养18 h。阳性对照组平板上菌落形态为鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。试验组上菌落形态与阳性对照组一致。阳性对照组麦康凯琼脂平板上有大肠埃希菌生长；试验组麦康凯琼脂平板上有大肠埃希菌生长。阴性对照组无菌落生长。见表4。

2.4.4 结果 从表4可以看出，阴性对照组未检出试验菌，试验组检出试验菌，因此盐酸沙格雷酯片控制菌检查可以采用薄膜过滤法。取本品10 g，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10供试液。取1∶10的供试液10 ml薄膜过滤，分两张滤膜过滤，每膜5 ml，加入规定量试验菌(不大于100 cfu)，取两滤膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。

表3 粗滤处理后1∶10和1∶50供试液薄膜过滤法测定试验组比值(n=3)

表4 控制菌检查法方法适用性试验结果

注：“+”表示液体培养基变浑浊，或分离平板上有菌落生长，且生长特征与相应目标菌标准菌株一致。“-”表示液体培养基澄清，或分离平板上无菌生长，或有菌生长但生长特征与相应目标菌标准菌株不一致。 “/”表示空白。

3 讨论

3.1 通过上述方法摸索，成功建立了盐酸沙格雷酯片的微生物限度检查方法。《中国药典》2015年版将500 r/min离心3 min处理供试液的方法取消，这是出于“需氧菌总数”计数里包含霉菌和酵母菌计数的考虑，因为霉菌和酵母菌菌体较细菌重量大，在离心的过程中，会随着药渣离心到下部分，若药品被这些菌污染，则检验结果并不能完全真实反映药品的污染情况，对患者的使用带来了潜在的安全隐患。这个供试液处理方法的取消，对于本身具有抑菌性的口服固体，尤其是含有药渣的药品的微生物限度检查方法的建立带来了一定的困难。本课题采用带过滤功能的均质袋进行粗滤，可以截留一部分颗粒比较大的药渣，减少试验中薄膜上药渣残留过多导致无法冲洗或者药渣残留过多导致薄膜上无法计数的问题，以及药渣的残留导致药品的抑菌性无法消除，从而试验菌的回收率无法达到《中国药典》要求的困局。

3.2 《中国药典》2015年版方法接种和稀释的步骤中，将供试液和试验菌混匀后，再加入到平皿中或者进行薄膜过滤的操作。这样的操作更能真实的反映药品被微生物污染的情况。

3.3 根据实际操作经验，在接种和稀释的步骤中，供试液和菌液的混合时间不宜太短，应至少混合5～10 min之上，保证药品和试验菌的充分混合，以及试验更好的重复性，更真实地模拟药品被微生物污染的情况。

3.4 方法适用性试验表明，盐酸沙格雷酯片的微生物限度方法为：取本品10 g至无菌三角瓶中，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，振摇使分散均匀，作为1∶10的供试液。取1∶10供试液20 ml，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，制成1∶50供试液。将三角瓶中1∶50供试液全量置于带过滤功能均质器专用袋大体积一侧中，在拍打仪中充分拍打30 s。取过滤后小体积一侧的试液作为粗滤1∶50供试液进行计数试验。取粗滤1∶50供试液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 ml分5次进行冲洗，取滤膜贴于相应的培养基上，依法进行需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数检查。取1∶10供试液10 ml薄膜过滤，分两张滤膜过滤，每膜5 ml，取两滤膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，依法进行大肠埃希菌检查。

1 中国药典[S]. 四部.2015：140-151

2 中国药典[S]. 二部.2010：附录107-116

3 美国药典[S]. 38 版. 2015：106-120

4 欧洲药典[S]. 8.0版．2014：185-194

5 李趣嫦，江艳芳.《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较[J].中国药品标准，2015，16(2):86-90

2016-07-22

R927.11

A

1006-5687(2016)05-0014-04