大鼠被动皮肤过敏试验影响因素探讨

王 冲，侯 娟，戚文军，于 彤，芮 菁

(天津市药品检验所，天津 300070)

实验研究

大鼠被动皮肤过敏试验影响因素探讨

王 冲，侯 娟，戚文军，于 彤，芮 菁

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：系统性研究大鼠被动皮肤过敏试验(PCA)的影响因素，为选择敏感试验条件和提高试验预测的准确性提供依据。方法：采用卵白蛋白(OVA)为PCA试验抗原，在不同条件下(OVA致敏剂量、添加佐剂、佐剂用量、致敏和被动致敏动物体质量及致敏时间)进行PCA试验。结果：①在不加弗氏完全佐剂(FCA)的条件下，在2.5～80 mg/只剂量范围内均未得到PCA阳性结果。②FCA显著增加大鼠肌体免疫应答的敏感性；加用FCA时，OVA用量宜选用5～20 mg/只。③以每只动物致敏1 ml计，0.4 ml FCA∶0.6 ml溶媒、0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒及0.6 ml FCA∶0.4 ml溶媒三种配比方式均可用于PCA试验。④推荐最佳实验动物体质量为200～300 g。⑤致敏后12～14 d，PCA蓝斑直径可达峰值，最短致敏周期为8 d。结论：OVA致敏剂量、添加佐剂、佐剂用量、致敏和被动致敏动物体质量及致敏时间因素均对PCA结果有影响，试验时应予以重视。

被动皮肤过敏试验，OVA，FCA

被动皮肤过敏试验(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)，是一种利用与同种或异种动物组织有结合性的抗体所引起的局部过敏反应，检测抗体或抗原的高敏感度方法。该方法为国家食品药品监督管理局《药物非临床研究技术指导原则》(下文简称《指导原则》)所推荐[1]，结合全身主动过敏试验(ASA)，共同评价药物免疫原性或抗Ⅰ型变态反应作用[2]。PCA的试验方法在《指导原则》中虽有规定，但均为原则性描述，缺乏具体操作的指导性作用。国内虽已有学者对试验动物品系[3]、注射途径[4]及假阴性试验结果[5]等影响因素做了有益的探讨，但仍存在一些影响因素尚未见报道，值得进一步研究。本试验继续对PCA试验的影响因素进行探索，以期甄选出敏感的实验条件，提高试验稳定性。

1 材料与方法

1.1 动物 大鼠(SD)，SPF级，雄性。动物来源：北京维通利华实验动物公司，生产许可证号SCXK(京)2012- 0001。大、小鼠维持饲料来源：北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK(京)2009-0012。饲养条件：动物饲养室温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，实验动物使用许可证号SYXK(津)2011-0007。人工照明，12 h明/12 h暗。实验动物于环境中适应至少3 d后用于实验。

1.2 药品 卵白蛋白(OVA，Sigma公司，批号SLBK1399V)；弗氏完全佐剂(FCA，Sigma公司，批号SLBJ2846V)；氯化钠注射液(NS，中国大冢制药有限公司，批号3J79D1)；乌拉坦(天津市华东试剂厂，生产日期2013年5月6日)；伊文思蓝(北京化学试剂公司，批号130535)。

1.3 设备 XS-205及XP2001S型电子天平(梅特勒公司)；数显游标卡尺(美国CT公司生产)；VELOCITY 18R型离心机(Dynamica公司)。

1.4 方法

1.4.1 OVA致敏剂量对PCA试验的影响 致敏：取雄性SPF级SD大鼠18只，体质量180～220 g，随机分为6组，每组3只。各组大鼠分别经腹腔注射给予卵白蛋白溶液2.5、5、10、20、40及80 mg/只致敏，每次注射体积为1 ml/只，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，将动物以25%乌拉坦麻醉后，经腹主动脉取血，静置凝固20 min以上，2 500 r/min离心10 min，分离抗血清原液，将每组动物的抗血清混合，-4 ℃保存备用。被动致敏：另取雄性SPF级SD大鼠36只，体质量180～220 g，随机分为6组，对应致敏试验中2.5、5、10、20、40及80 mg/只剂量组，每组6只动物。被动致敏的前1 d，将各组动物背部脊柱两侧常规脱毛备皮。配制各组抗血清原液及其氯化钠注射液稀释液(1∶2、1∶4和1∶8稀释液)，每组将原液及不同稀释度的抗血清分别于脊柱两侧脱毛区内进行皮下注射被动致敏大鼠，每点注射0.1 ml，两点之间相距约2 cm，48 h后分别静脉注射10 mg/ml卵白蛋白与1%伊文思兰等体积混合液 1 ml/只激发。激发后30 min，处死大鼠，剪取背部皮肤并翻转，测定注射点部位对应皮内蓝斑直径，直径在5 mm 以上者判定为阳性，比较各组被动皮肤过敏阳性比例。被动皮肤过敏阳性比例=各组抗血清原液蓝斑> 5 mm的动物只数/各组动物总数。

1.4.2 加用佐剂对PCA试验的影响 致敏：取雄性SPF级SD大鼠18只，体质量180～220 g，随机分为6组，每组3只。取5、10、20、40、80及160 mg/ml的OVA溶液与FCA等体积混合均匀后作为致敏液，分别腹腔注射1 ml/只，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，将动物以25%乌拉坦麻醉后，经腹主动脉取血，静置凝固20 min以上，2 500 r/min离心10 min，分离抗血清原液，将每组动物抗血清混合，-4 ℃保存备用。另取雄性SPF级SD大鼠36只被动致敏，方法同“1.4.1”。

1.4.3 佐剂用量对PCA试验的影响 取雄性SPF级SD大鼠18只，体质量180～220 g，随机分为6组，每组3只。分别取FCA与NS按照0.25∶0.75、0.3∶0.7、0.4∶0.6、0.5∶0.5、0.6∶0.4及0.7∶0.3的比例混合，加入适量卵白蛋白混合均匀至其终浓度为10 mg/ml，腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，将动物以25%乌拉坦麻醉后，经腹主动脉取血，静置凝固20 min以上，2 500 r/min离心10 min，分离抗血清原液，将每组动物抗血清混合，-4 ℃保存备用。另取雄性SPF级SD大鼠36只被动致敏，方法同“1.4.1”。

1.4.4 动物体质量对PCA试验的影响 ① 致敏动物体质量对PCA试验的影响：分别取体质量为200、250、300、350、400及450 g的雄性SPF级SD大鼠各3只，各为1组。将20、25、30、35、40及45 mg/ml的OVA溶液与等体积的FCA混合均匀，分别腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，将动物以25%乌拉坦麻醉后，经腹主动脉取血，静置凝固20 min以上，2 500 r/min离心10 min，分离抗血清原液，将每组动物抗血清混合，-4 ℃保存备用。另取雄性SPF级SD大鼠36只被动致敏，方法同“1.4.1”。② 被动致敏动物体质量对PCA试验的影响：取雄性SPF级SD大鼠6只，体质量180～220 g。选取20 mg/ml的卵白蛋白溶液与等体积的FCA混合均匀后，动物腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，将动物以25%乌拉坦麻醉后，经腹主动脉取血，静置凝固20 min以上，2 500 r/min离心10 min，分离抗血清原液，将每组动物抗血清混合，-4 ℃保存备用。分别取体质量为200、250、300、350、400及450 g的雄性SPF级SD大鼠被动致敏，其他操作同“1.4.1”。

1.4.5 致敏时间对PCA试验的影响 取雄性SPF级SD大鼠36只，体质量180～220 g，随机分为6组，每组6只。将20 mg/ml的卵白蛋白溶液与等体积的FCA混合均匀后，各组动物腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。各组依次于首次致敏后第8、10、12、14、16及18日，将动物以25%乌拉坦麻醉后，经腹主动脉取血离心分离抗血清原液，每组以6只动物被动致敏，方法同“1.4.1”。

2 结果

2.1 OVA致敏剂量对PCA试验的影响 OVA作为抗原，2.5、5、10及20 mg/只的4个剂量组PCA试验结果为阴性；OVA 40和80 mg/只的2个剂量组大鼠致敏后背部皮肤非注射点，明显可见多处散在分布蓝斑，直径均小于5 mm，色泽较浅，40 mg/只时出现比例为3/6，80 mg/只时比例为4/6，而注射点均未见蓝斑。结果表明，不添加佐剂时，OVA作为抗原，2.5、5、10、20、40及80 mg/只的6个剂量组，PCA试验反应均为阴性。结果见表1。

2.2 加用佐剂对PCA试验的影响 添加佐剂的情况下，OVA 2.5 mg/只时，PCA试验即成阳性反应，抗血清原液的阳性率为66.7%(4/6)，抗血清稀释液均呈阴性反应。伴随OVA剂量的逐渐增加，各浓度抗血清的蓝斑直径也逐渐增加，原液的阳性率均为100%(6/6)。5、10、20、40及80 mg/只5个剂量组，各组抗血清1∶2稀释液的PCA阳性率均可达83.3%(5/6)以上，1∶4稀释液阳性率均可达50%(3/6)以上。同一剂量OVA下，随着抗血清稀释倍数的增加，蓝斑直径及阳性率均呈抗原浓度依赖性递减。结果见表2。

2.3 佐剂用量对PCA试验的影响 FCA与NS比例为0.25∶0.75时，抗血清原液蓝斑直径最小，阳性率仅为50%(3/6)。伴随FCA剂量的逐渐增大，抗血清原液蓝斑直径及阳性率增加，0.4∶0.6、0.5∶0.5及0.6∶0.4三个比例组蓝斑直径最大，三者之间相互比较无显著性差异，各组分别与0.25∶0.75及0.3∶0.7组比较，有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。而0.7∶0.3组蓝斑直径下降，抗血清1∶2稀释液阳性率下降至66.7%(4/6)。结果见表3。

2.4 动物体质量对PCA试验的影响

2.4.1 致敏动物体质量对PCA试验的影响 致敏动物体质量为200、250及300 g时，抗血清原液蓝斑直径最大，三者相互比较无显著性差异。体质量大于300后，蓝斑直径随体质量增加而缩小，与200 g组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结果见表4。

2.4.2 被动致敏动物体质量对PCA试验的影响 被动致敏动物体质量为200、250及300 g时，抗血清原液蓝斑直径最大，三者相互比较无显著性差异。体质量大于300 g后，蓝斑直径随体质量增加而缩小，与200 g组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结果见表5。

2.4.3 致敏时间对PCA试验的影响 致敏12～14 d，蓝斑直径达到最大值，各稀释浓度蓝斑直径相互比较无显著性差异。致敏8 d，抗血清原液、抗血清1∶2稀释液即可产生阳性反应，阳性率均为100%，蓝斑直径分别与12～14 d比较均无显著性差异，提示PCA反应致敏时间最短可设定为8 d。结果见表6。

表1 OVA致敏剂量对PCA试验的影响

注：n表示阳性反应的动物数，N表示动物总数。

表2 加用佐剂对PCA试验的影响

注：n表示阳性反应的动物数，N表示动物总数。

表3 佐剂用量对PCA试验的影响±s)

注： 在同等抗血清稀释度下与0.25∶0.75组比较，*为P<0.05，**为P<0.01；在同等抗血清稀释度下与0.3∶0.7组比较，

# 为P<0.05，## 为P<0.01，n表示阳性反应的动物数，N表示动物总数。

表4 致敏动物体质量对PCA试验的影响±s)

注： 在同等抗血清稀释度下与致敏动物体质量200 g组比较，*为P<0.05，**为P<0.01

n表示阳性反应的动物数，N表示动物总数。

表5 被动致敏动物体质量对PCA试验的影响±s)

注： 在同等稀释度下与被动致敏动物体质量200 g组比较，*为P<0.05，**为P<0.01

n表示阳性反应的动物数，N表示动物总数。

表6 致敏时间对PCA试验的影响

注：n表示阳性反应的动物数，N表示动物总数。

3 讨论

PCA试验是一个错综复杂的试验过程，其结果受多种因素的影响，而《指导原则》中相关规定又欠具体，对如何取得良好的实验结果造成一定困扰。关于阳性药物的使用，《指导原则》中仅规定为“阳性对照组给予1～5 mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质”，再无其他相关说明。张冬梅等[6]PCA试验表明，在不添加佐剂的情况下，豚鼠是PCA试验最为敏感的模型动物，而大鼠PCA试验结果为阴性。蓝继奎[7]等试验结果也证实，卵白蛋白5 mg/只时PCA结果为阴性。本试验于不添加佐剂的情况下，单用OVA 2.5～80 mg/只，包含及远高于推荐剂量进行试验，均未能得到阳性反应。进一步证实，大鼠的PCA试验必须添加佐剂，建议《指导原则》中应明确表明。另外，本试验中发现，在未添加佐剂情况下，卵白蛋白40 mg/只及80 mg/只时，大鼠皮肤处非注射位点散在分布浅色蓝斑，直径均小于5 mm，考虑为产生低滴度抗体所致。

在添加FCA佐剂的情况下，可明显增加OVA的PCA阳性反应。OVA 2.5 mg/只即可产生阳性结果，但仅有抗血清原液呈阳性反应，且蓝斑色浅心空而不实。OVA 40 mg/只以上蓝斑直径过大不便区分界限，因而建议应用FCA为佐剂进行PCA试验时，OVA的用量宜选用5～20 mg/只。

FCA为油性乳剂，与抗原结合后，延长抗原在局部组织中的停留时间，降低抗原的分解速度，从而增强抗原免疫原性[4]，FCA用量则是影响这一过程的关键因素。FCA未商品化之前，各实验室以液体石蜡、羊毛脂及卡介苗的配方自行配制，过程极其烦琐，配得的成品按0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒(以每只动物注射1 ml计算)的推荐比例较难乳化均匀。FCA商品化以后，其可稀释程度有了较大的改善。0.25 ml FCA∶0.75 ml溶媒为可被乳化的最低比例，但需要研磨较长时间。本试验结果表明，该比例下PCA阳性率仅为50%。阳性率不高的原因可能为该比例下乳浊液的不稳定性，又或者是研磨时间过长，对OVA的活性造成了一定破坏。在0.4 ml FCA∶0.6 ml溶媒、0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒及0.6 ml FCA∶0.4 ml溶媒三个比例下，PCA蓝斑直径最大，且三者蓝斑直径大小无显著性差异，表明三种配比方案均可使用。使用0.4 ml FCA∶0.6 ml溶媒的比例用于药物安全性评价，特别是对于成品注射液，其暴露量较0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒的比例可提高20%。

动物体质量也是影响PCA试验成败的关键因素之一，本试验条件下，PCA阳性率随着致敏动物或被动致敏动物体质量增加而出现依赖性降低，应与动物的免疫力逐渐下降有关。依据本试验结果，推荐最佳动物体质量为200～300 g，且在该体质量下，动物周龄较小，尾部鳞片角质化程度较低，也便于激发给药时的尾静脉注射操作。

致敏时间也是影响试验的关键因素，同时也关系到试验的进度。致敏时间短，抗体蛋白难以生成；时间过长，抗体浓度可能会降低，均会造成试验结果的假阴性。本试验研究表明，首次致敏后12～14 d，PCA蓝斑直径可达峰值水平；致敏后18 d，蓝斑直径则具有一定的降低趋势；致敏后最短8 d，即可出现PCA阳性反应，且与蓝斑峰值时比较无显著性差异。综合考虑到时间与成本等因素，PCA试验时应尽量缩短致敏时间。

综上所述，本研究分别针对OVA致敏剂量、是否添加佐剂、佐剂用量、致敏及被动致敏动物体质量及致敏时间6个因素对PCA试验结果的影响进行了系统性研究，进一步完善并甄选出敏感的试验条件，为提高试验稳定性奠定了良好的实验基础。

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3 李秀芳，金若敏，符胜光，等 . 不同品系大鼠对天花粉蛋白诱导被动皮肤过敏差异性的比较研究[J]. 中药新药与临床药理，2010，21(4)：382-385

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5 梁宗星，郭琳，梁峰，等 . 大鼠被动皮肤过敏试验方法研究[J]. 毒理学杂志，2012，26(3)：195-197

6 张冬梅，刘延珍，单淑香，等 . 豚鼠和大鼠被动皮肤过敏试验[J]. 动物医学进展，2013，34(12)：241-243

7 蓝继奎，徐嘉红，徐晓玉 . 被动皮肤过敏试验影响因素初步研究[J]. 中药药理与临床，2008，24(2)：108-109

Study on experiment factors of passive cutaneous anaphylaxis in rats

Wang Chong, Hou Juan, Qi Wenjun, Yu Tong, Ruijing

(Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070)

Objective: To determine the optimal conditions for PCA tests to improve both sensitivity and accuracy of the tests by systematically studying the influence factors. Method: PCA experiments, with OVA as an antigen, were carried out under different conditions with an OVA sensitizing dose, with or without adjuvant, adjuvant dose, body weight of animal and sensitizing course. Results: ① In the absence of Freund’s Complete Adjuvant (FCA), no positive results were obtained with OVA within a scope of 2.5 to 80 mg/rat. ② FCA significantly enhanced sensitivity of immune system with OVA in a range of 5 mg/rat to 20 mg/rat. ③ If one milliliter was injected for sensitizing the animals, the following three solutions could be applied: 0.4 ml of FCA in 0.6 ml of the solvent, 0.5 ml of FCA in 0.5 ml of the solvent and 0.6 ml of FCA in 0.4 ml of the solvent. ④ Animals with a body weight of 200 to 300 g were the most sensitive for PCA tests. ⑤ After sensitization for 12 to 14 days, the diameter of dermal Evan’s spot reached the peak, and the shortest sensitizing course was 8 day. Conclusion: In the PCA experiment, we should pay enough attention to the factors mentioned here.

passive cutaneous anaphylaxis, OVA, FCA

2016-06-12

R965.3

A

1006-5687(2016)05-0001-05