高致病性禽流感抗体的检测与控制

左 韬

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830052; 2.新疆生产建设兵团第十师畜牧兽医站,新疆北屯 836099)

高致病性禽流感抗体的检测与控制

左 韬1，2

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830052; 2.新疆生产建设兵团第十师畜牧兽医站,新疆北屯 836099)

1 动物免疫抗体监测的重要性

动物免疫抗体监测是通过免疫血清学的方法对免疫后动物抗体水平的测定，根据免疫监测的结果来检验免疫成效的一种技术方法。检测免疫动物抗体水平，是检验免疫效果，掌握疫情动态的最直接、最有效的方法，动物的免疫抗体水平，可以为防控重大动物疫病提供科学的依据。

2 疫苗

禽流感疫苗是使用禽流感病毒通过增殖后灭活或者人工致弱，以及基因重组等措施，人工制造的用来防控高致病性禽流感的一类疫苗统称。按照生产工艺和制作方法的不同，可将禽流感疫苗分为以下多种：全病毒灭活疫苗、基因工程重组病毒灭活疫苗，基因工程亚单位疫苗、反向遗传疫苗、基因重组活载体疫苗、核酸疫苗、表位疫苗、转基因植物疫苗、冷适应流感弱毒疫苗、基因工程活流感病毒疫苗、复制缺陷型流感病毒疫苗等。

新疆地区多使用re-5株，re-6株生产的基因重组灭活禽流感疫苗，例如H5N1禽流感灭活苗、H5+H9二价灭活苗。

禽流感灭活疫苗免疫家禽后产生禽流感病毒抗体，来抵御外界同种亚型的禽流感野毒的侵袭，避免发生大规模疫病。或者通过注射疫苗，建立屏障和缓冲区域，对疫情进行封锁、包围和扑灭。由于饲养家禽个体素质的差异、养殖场所的管理水平、防疫人员的专业素养和疫苗的质量与运输环境的不同。因而造成被免疫动物产生的免疫抗体效价不同，从而抵抗外界病毒侵袭的能力不同，检测被免疫动物抗体水平，为防控重大动物疫病提供科学的依据。

本文论述主要依照GB/T18936-2003 高致病性禽流感诊断技术论述试验过程。

3 禽流感防控措施

3.1 建立科学的免疫程序

规模场家禽出栏时间短，而需要防控的传染病种类较多，因此要求规模场的家禽在有限的时间内进行多次免疫，这就要求养殖场制定出适合本场情况的免疫程序。免疫程序受着母源抗体和、免疫时间、免疫方法、疫苗种类、免疫次数和当地疫病流行情况等因素的影响。因此，应根据标准的抗体监测结果.选择最低抗体效价最低的时间作为再次免疫时间，选择了合适的免疫时机，就会大大增加免疫成功的概率。

3.2 利用检测数据，评估免疫效果

免疫动物整体抗体效价合格率、抗体效价均匀度、抗体维持时间是免疫质量的重要内容，与是否发生疫病直接相关。完成抗体监测后，及时通知监测区域所属乡（镇），对整体免疫合格率达不到70%以上水平时，及时补免，并调查分析影响免疫成功的因素和原因，收集外界信息，提高工作理论水平。

3.3 评价禽流感疫苗质量

在免疫前和免疫后2～3 周对免疫动物采血进行抗体检测并将抗体水平检测结果进行比对。可以确认免疫效果，同时通过每隔2-4周1次的抗体检测可以确定免疫有效保护持续时间.从而客观有效地评价疫苗质量。

3.4 重大动物疫病预警

禽流感病毒有两种纤突：血凝素有15个亚型。神经氨酸酶，有9个亚型。各种HA和NA都存在基因重组的可能。目前造成巨大经济损失的有（1）H7N7、H3N8马流感1型、二型；（2）H1N1及 H3N8来源于猪；（3）H4N5，H7N7来源于患病海豹；（4）H10N4来源于病貂；（5）H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H3N8引起人类呼吸道疾病；（6）几乎所有的神经氨酸酶NA和血凝素（HA）的组合都在禽类中发现，尤其是H5N1、H5N2、H7N1，以及H9N2引起“禽流感”。以及伊犁地区的H5N6高致病性禽流感。

家禽自然感染禽流感各种亚型病毒一段时间或者康复后.会在一定时间段带有该病原较高效价的抗体。检测到禽流感某亚型病毒特异性抗体后.可以初步确定该地区有家禽已感染或者是感染过某种疫病。对抗体检测呈阳性的动物.辅以病原学检测.对较早的发现禽流感疫情，动物疫病防控预警、制定防控措施有很好的帮助。

4 工作体会

4.1 保证高致病性禽流感抗体监测的准确性

抗原效价测定：必须使用无禽流感抗体的公鸡红细胞，不同种属动物红细胞对抗原效价测定有影响。

禽流感抗原首次使用时应分装多瓶后冻藏，每次使用时需要测定抗原效价。配制好的四倍禽流感抗原液需要及时使用，放置在4℃冰箱内抗原效价会下降。检测抗原效价可多检测几行，取抗原效价整数平均值。抗原效价测定完成后务必回归四倍抗原试验。

（1）被检血清的保存与稀释：被检血清需冷冻保存。检样时确实吸取被检血清50μl至每列第一孔。对于胶冻状血清，检测时尽量不吸取其中胶冻成分，以免出现跳孔或抗体效价不合格，确实无法吸取血清的样品略过不检（无检测价值）。

（2）添加抗原与作用时间：配制抗原的时间最好安排在被检血清稀释完成后，当次配制抗原当次使用。禽流感抗体检测最好批量完成，这样在配制抗原的过程中，减少误差，增强试验结果的真实性。

（3）添加红细胞与结果判定：红细胞采集工作最好一次足量，避免再次采集使用来与不同红细胞而测定抗原效价耽误试验时间；冲洗、储存红细胞的器具经过灭菌后使用，红细胞在4°冰箱内可保存一周。测定抗原效价红细胞与检测所用红细胞应一致。重新采集红细胞时需另测抗原效价。配制1%红细胞悬液时需要按照标准配置，红细胞浓度过高造成多量红细胞沉积在孔底，对读板造成影响；浓度过低也不便于读板。

4.2 减少试验中的错误和误差

4.2.1 错误

（1）在加样中出现错误：批量操作中第12孔空白对照只加入25ul PBS磷酸盐缓冲液。添加4倍抗原的过程中重复添加某一列或者漏加某一列。造成跳孔或者无法顺利读出试验结果。

试验人员没有掌握数量的操作技术导致试验失败、监测任务多且任务集中，时间短，在高强度的作业压力下，发生错误不能有效处理。又有多人操作，试剂的配置和保存以及使用出现用错液体或者试剂的情况。

（2）4倍抗原配制、使用错误：

图省事，使用上次测定抗原效价来配制当次试验用4倍抗原液；配制4倍抗原液后因故无法继续试验，而不弃去抗原液留待下次使用的。

4.2.2 误差

误差是正常试验中因为个人因素导致的试验结果不同的现象，误差可以减小，但不能避免。

（1）检测样品数量很少时，按照实际用量测算抗原使用量配制4倍抗原，此种配制方法误差较大，不检疫使用。

（2）判定标准不一致：

禽流感抗体检测后的试验结果判定过程中有一定的主观性，因此要求，一次的试验数据最好由一人判定完成，多人判定造成判定标准不一致，从而增加误差的范围。

4.3 数据理论

（1）形成良好的实验室工作习惯，实验前后及时登记实验室环境数据，使用仪器前后及时登记，配制试剂溶液如实填写试剂配制信息。

（2）按照实际情况记录试验结果，出现错误和误差时勇于追求真相，根据试验记录和试验信息仔细查找出现错误和误差的原因，积极提高试验操作水平和理论水平。

（3）合理利用试验结果进行防疫效果评估，流行病学调查等工作，利用试验数据，解决防疫人员和养殖场所的疑惑，并给予科学合理的答疑。

5 抗体效价数据的意义

5.1 合格：抗体效价合格率达到国家标准的大于等于70%

按照相关资料和农业部的免疫合格要求，禽流感群体免疫效价达到70%以上，可以抵御禽流感病毒的侵袭，能够产生屏障作用。

5.2 不合格：抗体效价合格率低于70%的国家标准

按照农业部《高致病性禽流感禽流感防控标准》，群体免疫合格率低于70%的，要及时补免，保证长年免疫合格率在70%以上。

（1）再次对试验试剂名称、厂家、批号和试验过程进行复核，确认试剂使用正确，保存条件适合，试验中未有操作失误，抗原对照，空白对照皆成立。

（2）出具检测报告书或者提出整改意见，立即通知被检单位（场所）或防疫员及时进行补免，补免21日后重新抽血进行检测。

（3）补免21日经检测仍不合格，考虑疫苗运输保存过程中是否全程处在冷链中，防疫人员领取疫苗后是否采取有效的保温措施，当日当次疫苗长期室温放置或者疫苗经阳光暴晒会导致疫苗免疫原性丧失，致使免疫失败。

血清反应板是否按要求已冲洗干净并灭活，一次性反应板质量不达标。

6 提高免疫合格率的一些措施

（1）按照出现问题的不同采用不同的解决方式，免疫抑制、改变免疫程序（对待母源抗体）、冷链断裂，进行技能培训，配置冷藏疫苗箱。设立奖惩制度。完善冷链设施设备。以及责任追究。

（2）重新补注疫苗后，两周后重新采血检测。严肃认真的态度，保证后续免疫工作的认真负责。

（3）应当配备一定的免疫副反应基金，减少因免疫出现死亡而产生的经济纠纷，减轻防疫员工作压力。