补肾益气明目方组方药物治疗视神经萎缩靶向机制初探*

赵子德，张莹莹，柏 梅，梁 俊，王军杰，魏彬彬，王 影△

(1. 中国中医科学院眼科医院，北京 100041； 2. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

视神经萎缩是由他病引起的视网膜神经节细胞及其轴突变性，表现为严重的视功能受损，尚无有效的治疗措施。唐由之教授是我国著名的中医眼科学家，在视神经萎缩(optic atrophy, OA)的中药治疗中积累了丰富的临床经验，提出“补虚化瘀法”，并围绕其经验方补肾益气明目方(党参、丹参、川芎、山茱萸、菟丝子、枸杞子、女贞子、生芪、熟地、当归)加减，临床收效显著[1]。

复方多药物组合及药物多组分给临床药理研究带来极大挑战。理清药物-疾病靶向关系对揭示复杂药理机制极为必要。“生物活性导向下的化学研究思路”的提出，重视以中药有效组分配伍的方剂架构新模式[2]，因此借助开放生物数据平台，以中药组分作用靶点为分析单元的临床药理研究，展现了极强的驱动力[3-5]。本研究拟基于该平台，对唐由之治疗视神经萎缩之补肾益气明目方，通过数据挖掘初步探索该方有效组分及分子靶向性。

1 材料与方法

1.1 药物有效组分及其靶点筛选

本研究通过检索中医药系统药理数据库和分析平台(TCMSP: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http:∥ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，在草药名称“Herb name”中分别输入各个中药中文名称，进入搜索“Search”后，再点击结果中显示的所输入中药的拉丁名称，在相关靶点“Related Targets”内容中，便可获取补肾益气明目方中10味中药相关的化合物及各化合物对应的分子靶点，在此基础上，结合药物靶点和药物作用信息数据库Drugbank(http:∥www.drugbank.ca/检索时间2015-7-18)，从中提取上述各中药已被验证的有效组分及其对应的分子靶点信息。

1.2 OA疾病靶标获取

利用囊括人类遗传、基因表型及疾病基因图谱数据库OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man http:∥omim.org/检索时间2015-11-29)，以“optic atrophy”为检索词进行搜索，从显示结果中便可获取数据库中收集的OA致病相关分子，将此作为本次研究的疾病靶标。

1.3 药物-疾病靶向分析

药物作用被归类为“中靶”与“脱靶”两种效应，药物直接扰动致病分子是靶向治疗的主要形式。通过筛选具有直接扰动OA分子靶标的药物、有效组分及其靶点信息，利用文献挖掘与信号通路数据库KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.kegg.jp)进行信号通路信息比对，初步探索其靶向机制。

2 结果

2.1 药物组分及其靶点

通过检索中医药系统药理数据库和分析平台，从中提取补肾益气明目方中各中药已被Drugbank数据库验证的有效组分，得到党参、熟地、丹参、当归、川芎、枸杞子、山茱萸、女贞子、菟丝子、生芪被验证的组分数目分别为11、5、20、6、14、14、22、19、7、13；上述各药物有效组分涉及的靶点基因符号(gene symbol)数目分别为133、48、180、28、138、172、135、285、156、218。

2.2 OA疾病靶标

通过OMIM数据库获得视神经萎缩疾病相关靶标分子(Gene Symbol)379个。

2.3 药物-疾病靶向分析

通过将经验方中各药物靶点与视神经萎缩靶标进行比对，本研究最终确定上述10味中药中的有效组分直接扰动视神经萎缩靶标分子数目分别为1、0、2、0、0、3、2、3、5、3，其中涉及5个有效组分luteolin(木犀草素)、protocatechuic acid(原儿茶酸)、quercetin(槲皮素)、vitamin A(维生素A)和sesamin(芝麻脂素)，5个直接扰动靶标EGFR(Epidermal growth factor receptor)、KIF21 A(Kinesin family member 21 A)、GJA1(Gap junction alpha-1)、ACOX1(Acyl-CoA oxidase 1)、G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)。

3 讨论

研究表明，攻击单个靶标对于复杂疾病几乎没有影响[6]，这可能源于系统具有鲁棒性，而抑制多个靶标比单一抑制更加有效，因此设计多靶点干预的有效药物组合极具挑战。本文针对补肾益气明目方10味组方药物的直接作用靶点和OA疾病靶标进行挖掘，OA显示其多基因复杂疾病特点，所有药物均呈现多组分多靶点特征，其中党参、丹参、枸杞子、山茱萸、女贞子、菟丝子、生芪的有效组分能直接干预OA靶标，且药物中靶显示出高度集中性。其中，菟丝子所含有效组分(sesamin、quercetin)占有最高“中靶率”，并呈现多角度干预。

3.1 促神经细胞的生成及稳态

结果显示，党参、丹参、枸杞子、女贞子、菟丝子、黄芪均可直接直接调控EGFR分子。EGRF是一种络氨酸激酶受体(RTK)，研究表明EGFR与配体结合促进自噬体与溶酶体的融合，从而维持神经胶质细胞的稳定状态[7]，防止细胞变性，而在受损区域星形胶质细胞可以形成不成熟的神经细胞[8]，随后又发育为成熟的神经细胞。而在果蝇体内，EGFR与配体Spitz(一种被视为转移生长因子-α样配体)结合时能促进神经上皮的增殖和成神经细胞的形成[9]。另外，利用轴突蛋白tau和神经元蛋白β微管蛋白/神经丝评估神经元细胞培养过程中轴突再生程度时发现，当EGFR过表达时Tau蛋白和β微管蛋白/神经丝被上调，在EGFR被阻断时后者被下调[10]，同时这种调控模式被发现存在于EGFR与mTOR和Akt之间，mTOR和Akt则在胎儿鼠和幼鼠的神经元细胞中高度表达，而在老年鼠中低表达，这表明EGFR在mTOR和PI3K / Akt通路激活条件下具有调节神经元固有再生的重要潜力。

3.2 胞间信号传导及运输动力调控

GJA是枸杞子、山萸肉、女贞子、菟丝子、黄芪共同的目标调控分子,是一种间隙连接蛋白，这种蛋白在人类视神经网膜组织中主要表达于神经胶质细胞、血管和上皮细胞，并参与线粒体基质离子流动和呼吸调节。6个连接蛋白形成一个连接子或质膜半通道，这种通道具有相对非特异性，允许小于1000道尔顿的分子以被动扩散的形式通过，如可以影响细胞发育命运被称为形态发生素的一组生化分子等。在病理条件下，损伤的细胞可能通过间隙连接影响周围健康细胞，相反必要的营养物质也可以通过间隙连接供给临近健康细胞而避免损伤。研究表明,间隙连接蛋白可能牵连着中枢神经系统损伤后神经元死亡的病理[11]。利用基因敲除/敲入技术，连接蛋白被证实对脑组织缺血再灌注损伤具有重要保护作用[12]。在诱导细胞毒性或缺血条件下，间隙蛋白的药理阻断还可以终止几乎所有视网膜无长突细胞的丢失以及降低大部分神经节细胞的丢失[13]。此外，EGFR和GJA同位于间隙连接通路(Gap junction pathway)的上游位置，且该通路显示涉及视皮层与视网膜功能、细胞凋亡、钙离子平衡等调控。间隙连接包含细胞间通道，不同于体内神经、内分泌交互机制，这允许相邻细胞之间通过细胞质进行短程通讯[14]。间隙连接通讯被认为不论对中枢神经系统还是外周神经系统的髓鞘和轴突生存都至关重要[15]，分别通过介导少突-星形胶质细胞间和雪旺氏细胞间的胞间通讯。在脱髓鞘神经胶质中，间隙连接调控着生理过程，如细胞的生长、增殖、钙信号传导以及参与连接蛋白构成的半通道所释放的神经递质介导的细胞外信号传导。因此，针对这类间隙蛋白的干预被认为是新的治疗策略，以减少神经病理条件下逐渐损失的细胞。

另外，KIF21 A是正端走向驱动蛋白家族中的一员，在神经元中这一蛋白通过利用ATP水解释放能量，沿轴突微管运输必要细胞组分[16]，驱动蛋白活性的严格调节与神经系统发育及神经系统致病密切相关[17-18]，尽管较多的研究集中在KIF21 A与眼动神经之间的关系。因此，方中药物针对EGFR、GJA、KIF21 A的调控关系到胞间信号转导及运输动力调控等方面，可能涉及神经细胞重要的物质和能量代谢过程。

3.3 抑制退行进程与抗氧化

过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶是由ACOX1编码的一种蛋白，ACOX1的缺乏是过氧化物酶体长链脂肪酸氧化的一种罕见性疾病，它的缺乏在人类可能引起包括视神经萎缩在内的致命性神经退化过程，即神经元的丢失导致持续脱髓鞘改变[19]，严重的神经系统异常在该基因敲除小鼠模型中同样可以观察到[20]。G6PD是一种存在于人体红细胞内、协助葡萄糖进行新陈代谢的酵素。研究表明，G6PD的缺乏可以降低缺血性视神经病变的风险[21]，这可能是由于其缺乏而导致NADPH产生不足，降低NADPH依赖的氧化酶衍生的活性氧，保护组织或器官免受氧化损伤[22]。然而G6PD似乎是把双刃剑，这源于其高表达在缺血再灌注期间又呈现出对抗DNA氧化损伤及防止神经退行性病变等神经保护作用[23]。

综上可见，唐由之经验方组方药物可能通过其有效组分直接命中多个OA靶标，其机制涉及促神经细胞的生成及稳态、胞间信号传导、胞间运输动力调控、抑制退行进程、抗氧化等神经再生和神经保护等。组方药物间存在共享和独有靶点，预示着可能存在药物联合应用的复杂机制或组方机制。在此，大数据分析为深入揭示方证、方病相关性带来巨大潜力[24]，未来研究将基于网络药理学理论框架进一步解析该组方药物有效组分靶点与OA疾病靶标之间的复杂关系，并进行生物学验证，揭示其组方机制，指导临床用药(致谢：感谢唐由之教授对本研究的支持)

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