血清肌钙蛋白-I均相化学发光免疫检测方法的建立

董 明

（湖北省十堰市郧西县中医医院检验科，湖北 十堰 442600）

血清肌钙蛋白-I均相化学发光免疫检测方法的建立

董 明

（湖北省十堰市郧西县中医医院检验科，湖北 十堰 442600）

目的 通过光激化学发光法建立一种血清肌钙蛋白-I的均相免疫检测方法，并探究其应用价值。方法 我院2015年2月至2015年8月间收治的急性心肌梗死患者50例作为研究对象，并以同期接受体检的健康志愿者50例作为对照，采用光激化学发光法建立的免疫检测法对其血清肌钙蛋白-I水平进行测定，并对该方法进行评价。结果 高值血清、中值血清、低值血清标本的批内、批间变异系数均≤10%，重复性良好；分析灵敏度与功能灵敏度分别为0.048 ng/mL、0.055ng/mL，加入干扰物后的干扰率均≤10%，加入不同浓度标准品后的回收率分别为106.56%、103.73%。本文建立的实验结果与直接化学发光法检测结果相关性良好（r2=0.982）。结论 在光激化学发光法基础上建立的血清肌钙蛋白-I检测方法，具有检测精密度高、重复性好，灵敏度、特异性、准确度俱佳，抗干扰能力强，且无需清洗分离的优点，通过方法的进一步优化可以为临床推广应用奠定基础。

血清肌钙蛋白-I；急性心肌梗死；化学发光免疫法；检测

本文就我院2015年2月至2015年8月间收治的急性心肌梗死患者50例作为研究对象，以光激光化学发光法为基础建立一种血清肌钙蛋白-I检测方法，分析其检测效果，并对其进行方法学评价。具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取我院2015年2月至2015年8月间收治的急性心肌梗死患者50例作为研究对象，所有患者均符合中华医学会心血管分会制定的《急性心肌梗死诊断和治疗指南》中的相关诊断标准。50例患者中，男31例，女19例；年龄在34～82岁，平均（52.1±3.7）岁。另取同期在我院接受体检的健康志愿者50例作为对照，其中，男30例，女20例；年龄在34～79岁，平均（51.5±3.5）岁。两组受检者在性别、年龄等方面的比较均无统计学差异，P＞0.05，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清肌钙蛋白-I检测方法的建立。制备肌钙蛋白-I受体-受体微球：使用浓度为0.05 mol/L的MES缓冲液度对预标记的肌钙蛋白-I多克隆抗体进行透析，并通过紫外分光光度仪对其浓度进行测定。在0.05 mL MES缓冲液中加入0.5 mg发光微球行超声再悬浮后，将其与0.1 mg处理后的抗体、MES缓冲液混匀得到反应液，加入25倍氰基硼氢化钠，在室温下连续反应48 h，再加入体积为反应液1/5和1/10的甘氨酸、氰基硼氢化钠旋转反应后，按照5∶8的比例加入牛血清白蛋白，过夜反应，反应温度为4 ℃。经MES缓冲液清洗后，将得到的受体微球进行稀释，稀释浓度为1 mg/mL。

标记生物素并配制标准品：以3 mL DMF溶解活化生物素0.1 g，逐渐加入肌钙蛋白-I单克隆抗体溶液中，室温反应1 h后，以PBS溶液透析，将游离生物素去除后，分装保存。将肌钙蛋白-I纯品用灭活小牛血清、PBS溶液配制成浓度分别为0、2.5 ng/mL、8 ng/mL、24 ng/mL、36 ng/mL、100 ng/mL的标准品溶液，标定后分装备用。

测定：在发光微孔板内依次加入生物素标记抗体、标准品（待测样本）、受体球（均为25 μL）混匀后，于避光条件下加入链霉素及供体微球（加入量为175 μL），混匀后读取光信号值，肌钙蛋白-I标准品-光信号值的标准曲线绘制完成后，可以据此获得待测样本中肌钙蛋白-I的水平。

1.2.2 方法学评价。精密度评价：采集健康志愿者的血液标本，通过处理后将获得的血清混合，并将其配制成不同浓度的待测标本，保存在-20 ℃的冰箱中待检，同一实验的同一标本做十次检验，并对其批内精密度进行计算；同时，对3种不同标本连续10 d的测定值进行记录，计算批间精密度。

灵敏度评价：选择不含肌钙蛋白-I的标准品进行反复测定，记录十次测得的光信号值，并分别计算其平均数与标准差，利用标准曲线对分析灵敏度进行计算；同时，选择低值样本再次进行倍比稀释，分装保存，将统一系列不同值的样本进行连续测定，每天重复精密度为20%的对应浓度记为功能灵敏度。

特异性评价：分别向低值血清与高值血清中加入血红蛋白（5 g/L）、三酰甘油（11 mol/L）、总胆红素（240 μmol/L）、蛋白质干扰物（12 mg/dL）进行干扰实验，并以加入不含肌钙蛋白-I等体积基质的样本为基础样本，分别对其浓度进行测定，并以基础样品测定浓度与分析样品测定浓度之差/基础样品测定浓度的百分比为干扰率。

准确度评价：将混合后的健康志愿者血清分3份，并在其中2份中加入等体积的标准品，浓度分别为8 ng/mL、36 ng/mL，另一份中加入无肌钙蛋白-I的基质，分贝对不同样品的浓度值进行检测，并按照分析样品测定浓度与基础样品测定浓度之差/加入浓度的百分比为回收率。

与直接化学发光法检测结果的相关性实验：分别采集50例急性心肌梗死患者的血液标本，采用本文建立的方法与直接化学发光法分别进行测定，并行相关性实验。

1.3 统计学方法：本次实验数据采用SPSS12.0软件进行统计学分析，相关性分析采用person分析法，P＜0.05具有统计学差异。

2 结 果

2.1 精密度：高值血清、中值血清、低值血清标本的批内变异系数分别为5.23%、4.97%、3.41%，批间变异系数分别为7.23%、8.54%、8.22%，均≤10%，重复性良好。

2.2 灵敏度：经计算，分析灵敏度与功能灵敏度分别为0.048 ng/mL、 0.055 ng/mL。

2.3 特异性：低值血清加入血红蛋白、三酰甘油、总胆红素、蛋白质干扰物后的干扰率分别为9.21%、9.34%、9.18%、9.03%；高值血清中加入血红蛋白、三酰甘油、总胆红素、蛋白质干扰物后的干扰率分别为8.23%、8.02%、8.00%、7.81%。

2.4 准确度：加入浓度为8 ng/mL的标准品后，回收率为106.56%；加入浓度为36 ng/mL的标准品后，回收率为103.73%。

2.5 与直接化学发光法的相关性：将本文建立的实验结果与直接化学发光法检测结果进行相关性分析，r2=0.982，相关性良好。

3 讨 论

近年来，随着经济水平的发展和物质生活水平的不断提高，人们的生活方式、饮食结构都出现了巨大的改变，与之密切相关的心血管疾病发生率也呈现快速上升的趋势，严重威胁人类的健康和生命安全。急性心肌梗死就是十分严重的一种，早期发现、诊断和治疗是挽救急性心肌梗死患者的重要途径[1]，特别是对于非ST段抬高型的急性心肌梗死患者而言，其临床症状不典型，心电图改变不明显，容易被忽视而造成严重后果，而血清肌钙蛋白-I作为一种心肌损伤标志物在心肌损伤的诊断中具有良好的敏感性和很高的特异性，被认为是急性心肌梗死的诊断金标准[2]，对血清肌钙蛋白-I的水平进行定量测定也可以对心肌梗死面积进行反映，利于继发性心肌梗死或者复发性心肌梗死患者的及时发现[3]。

临床检测血清肌钙蛋白-I的方法包括金标免疫层析法、酶联免疫分析法、放射免疫法等多种，金标免疫层析法在实践应用中虽然操作简便，标本用量也很少，但其受主观影视影响大，且无法实现定量测定；酶联免疫分析法的显色灵敏度较低，同样无法实现完全的定量测定；而放射免疫法的放射污染大，使用限制较大。化学发光免疫分析法虽然同时具备了良好的检测灵敏度、特异性，能够实现自动化定量分析，但检测费用较高，推广难度大。选择一种灵敏度高、特异性强、背景干扰小、安全性好、精度高、能实现定量检测、经济性好、普及度广的肌钙蛋白-I检测方法对于急性心肌梗死患者具有重要意义。

本实验中使用的光激化学发光系统以能量的近距离转移为核心，可以在抗原-抗体特异性反应的基础上，把激发态单线态氧供体球的极短距离传递，转移到受体球，并使其发光，通过绘制不同浓度标准品对应的光信号值制作标准曲线，并获得可以用来测定样本被测物含量的数学模型，其有检测均相，无需清洗分离的优势[4]，以双抗体夹心法为基础，通过光激化学发光系统的应用，能够实现血清肌钙蛋白-I的快速、敏感检测，且价格相对较低。本文对该法进行方法学评价，可见其精密度高、重复性好，且有良好的灵敏度、特异性、准确度，抗干扰能力强。将其与直接化学发光法的测定结果进行相关性分析，则可见其r2为0.982，相关性好，检测效果可靠。当然，在实践应用过程中，还需对相关的实验条件进行优化，对相关问题进行进一步分析和解决，为其临床推广奠定基础。

[1] 程敏卓,张向辉,赵卫国.基于光激化学发光技术开发的多表位检测cTnI的方法[J].免疫学杂志,2014,30(9):825-827.

[2] 石兴景.两种方法测定肌钙蛋白I结果的比对分析[J].中国医疗前沿,2011,6(8):67-69.

[3] 贾娟娟,刘一兵,张雪峰,等.人心肌肌钙蛋白I酶促化学发光免疫分析方法的建立[J].标记免疫分析与临床,2012,19(5):282-284.

[4] 李玉芹,牛文彦,朱黎娜,等.血清肌钙蛋白-I均相化学发光免疫检测方法的建立[J].实用医学杂志,2014,30(10):1640-1642.

R542.2+2

B

1671-8194（2017）18-0171-02