念珠菌菌株分型实验研究进展

项国仕， 程 曦， 黄孝天

·综述·

念珠菌菌株分型实验研究进展

项国仕， 程 曦， 黄孝天

念珠菌； 菌株分型； 基因分型； 分型方法

菌株分型是通过分类，比较不同分离株之间的遗传相关性和差异性，并结合其流行病学特点，探讨菌株之间进化关系的一种研究手段。临床念珠菌分型在研究其物种相关性、评估流行病学、追溯流行源头、控制和预防临床感染以及抗真菌药物研发和抗真菌治疗等方面具有重要的指导意义。本文将从原理和优缺点等方面，介绍当前念珠菌属主要分型方法及新型分型方法，包括基于蛋白/酶的分型方法、基于精准DNA序列的分型方法、无需精准DNA序列的分型方法等。

1 基于蛋白/酶的分型方法

1.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）

研究证实质谱仪可以用于细菌分型，病原菌鉴定通常基于不同种属微生物的保守蛋白峰，而对同一物种的高分辨力分型则依赖于不同分离株特异的蛋白峰[1]，其鉴定的结果稳定、可靠[2]。2009年，MALDI-TOF MS被首次用于酵母的鉴定，2011年，开始将其应用于酵母和类酵母等的分型。随着念珠菌MALDI-TOF MS蛋白质谱数据库的不断完善，MALDI-TOF MS用于临床念珠菌分型成为可能。

MALDI-TOF MS最突出的优势是简易快速、重复性较好，并且具有高通量、所需材料少等特点，尤其适合于临床病原微生物暴发的相关研究[3]。MALDI-TOF MS可以通过建立蛋白质谱数据库以用于不同临床分离株的对比和不同实验室的交流，但是目前单一念珠菌物种的蛋白质谱数据库并不完善，一些罕见念珠菌的蛋白图谱尚未被现有数据库收录。2014年，De Carolis等[4]利用MALDITOF MS和扩增片段长度多态性（AFLP）分别对近平滑念珠菌复合体进行了鉴定和分型，结果证明，两种方法对于近平滑念珠菌复合体的鉴定与核糖体DNA测序结果一致；MALDI-TOF MS分型结果与AFLP相似，但作为真菌分型工具，其利用价值需要进一步评估。目前，MALDI-TOF MS在微生物分型方面尚未普及，且没有规范化的操作或标准，因此具有很大的研发空间和潜能。

1.2 多位点酶电泳（MLEE）

MLEE的理论依据是“一基因一酶”学说，它是基于菌株同工酶（isoenzymes）或异型酶（allozymes）（主要为代谢酶，代谢酶基因在环境选择压力下比较稳定）多态性的一种分型方法。2012年，Santos等[5]利用MLEE对分离于阴道念珠菌病患者的28株白念珠菌进行了分型，其中16株白念珠菌为高度相关，证明MLEE具有强大的菌株区分能力和很好的重复性。然而，至少需要检测10种以上的酶才能使菌株之间具备足够的可变性，这无疑增加了实验成本。另外，由于所检测的代谢酶基因变异缓慢以及密码子的兼并性等因素，导致MLEE并没有足够的灵敏度以检测出念珠菌亚种的快速而细微的变化[6]。最后，MLEE分型不便于不同实验室之间的数据交流和对比研究。尽管如此，在评价菌株遗传相关性时，这种分型方法优于其他一些流行的DNA印记的方法。

2 基于精准DNA序列的分型方法

2.1 重复序列依赖PCR（REP-PCR）

REP-PCR是目前较为常用的分型方法之一，该方法使用特异引物扩增贯穿于真菌基因组的非编码短重复序列，扩增片段经琼脂糖凝胶电泳分离后染色，即可显示出不同的带型。目前，REPPCR因其快速、经济而被广泛用于多种临床病原微生物的流行病学研究中，如白念珠菌及其他念珠菌等[7-8]。

REP-PCR分型技术不仅可以很好地区分种间差异，同时能够揭示种内差异。它具有与随机扩增多态性DNA（RAPD）类似的优点：简单快捷、经济方便。相对于RAPD分型，REP-PCR使用特异引物，图谱条带更加清晰，而且重复性更好。2014年，Tamai等[7]对分离于HIV阳性患者口腔的100株白念珠菌进行了25S rDNA分型，结果分为3个基因型（A型、B型和C型）；随后利用靶向PRS基因ALT重复序列的特异引物分别对3种基因型的菌株进行REP-PCR分型，将每种基因型的菌株进一步分为4个亚型，证明REA-PCR是一种快速简单的基因分型技术，不仅可以从近缘种中区分出白念珠菌，并且对于念珠菌感染皮肤病学分子水平上的管理和控制非常有用。然而，与RAPD一样，REP-PCR分型技术同样也受实验条件的影响，PCR所用的Mg2+浓度、Taq酶来源、模板完整性以及PCR仪自身的不稳定因素等都可能影响最终的带型。目前市场上已有商品化REPPCR分析系统，可实现REP-PCR的半自动化和规模化，并且具有更简便、标准化、高重复性的特点。

2.2 微卫星长度多态性（MLP）

MLP基于基因组中由2～6 bp短重复序列组成的微卫星序列拷贝数的高度变异性。MLP根据特定微卫星序列设计引物，PCR扩增该微卫星位点的核心序列和部分侧翼序列，扩增产物经凝胶电泳分离形成不同大小的条带。Li等[9]对白念珠菌的微卫星分析分型系统作了改进并广泛用于白念珠菌及其他念珠菌[10]的基因分型。

MLP是一种新型有效的分型方法，其突出的优势在于高分辨率、高通量、自动化，甚至可以建立数据库用于不同实验室交流或数据的比较研究。然而，MLP分辨力依赖于所用的微卫星标记，不同实验室难以实现标准化程序。此外MLP重复性不高，容易受实验条件影响。Li等[11]建立了一项基于单链构造多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技术的PCR-SSCP方法，使用CAI引物进行微卫星多态性分析，不仅可以获得较高的分辨力，而且该方法同时检测3个不同水平的微卫星多态性，已成为临床实验室白念珠菌快速分型和微进化检测有力的、经济的分型方法。

2.3 多位点序列分型（MLST）

MLST是由MLEE衍化而来的一项基于测序技术的基因分型技术。MLST基于6～11个管家基因（500 bp左右）的内部片段核苷酸序列中的多态性位点（SNP），每一个管家基因片段所有SNP的排列组合形式按照发现的先后顺序分配一个等位基因号（allele number），所有等位基因号组成菌株的等位基因图谱，每一个不同的基因图谱分配一个序列号，即为该菌株的序列型（sequence type， ST）。遗传相关的菌株等位基因号的排列组合相似，反之，不相关菌株的亲缘关系较远。2003－2004年，Bougnoux等[12]评估了MLST在白念珠菌分型中的价值，并确定了白念珠菌MLST分型的国际金标准。

MLST突出表现是拥有标准化策略、数字化数据、高分辨力、高重复性和高准确性的特点。2015年，Wu等[13]利用MLST对62株白念珠菌进行分型，共得到50个ST，其中新发现41个ST，证明MLST是研究白念珠菌流行病学和进化的有用工具。MLST分型是目前唯一建立了数据库的基因分型方法，目前已建立了MLST数据库的念珠菌包括白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌等4种临床常见念珠菌。MLST分型标准化的策略和数据库的建立使其可以在全球范围内各国家或地区的不同实验室之间，通过互联网进行交流、比较以及数据更新。因此，MLST分型是念珠菌群体遗传、分子系统发生学和流行病学研究的最佳手段之一。

然而，MLST分型的成本较高，对于一些地区或实验室并非能首选。MLST分析的管家基因片段大小在300～500 bp，并且分布于特定的几条染色体上，因此，相同序列号的菌株之间实际上在待测片段以外的其他区域序列可能并不相同；不同SNP排列组合可能因念珠菌的二倍体性质而分配到同样的序列号；此外，一些念珠菌如近平滑念珠菌的管家基因序列差异较小，这些物种并不适合使用MLST分型[14]。

3 无需精准DNA序列的分型方法

3.1 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

PFGE技术利用规律变化的电场来促使染色体片段在凝胶中迂回迁移而达到分离染色体片段的目的。相对于染色体大小为1～4 Mb的念珠菌而言，PFGE是一种分离染色体DNA分子、分析染色体带型以及检测染色体组型变化的理想方法。目前基于PFGE技术的分型方法包括核型分析（electrophoretic karyotyping，EK）和染色体限制酶片段模型（chromosomal restriction fragment pattern）等。EK被广泛地运用于白念珠菌及其他念珠菌分型中。其优点是重复性好，对带型的解释明确。然而，受念珠菌染色体数目以及单个染色体大分子量的限制，EK并没有足够的能力区分中度相关的分离株，也不能检测出同一菌株微进化。另一方面，EK操作复杂枯燥，所需设备成本高，并且耗时费力。

3.2 RAPD

RAPD分型技术使用1条含8～10个碱基的随机引物，以基因组DNA为模板，在较低严格条件下（如退火温度为35 ～40 ℃，Mg2+浓度为2.5 mmol/L）进行PCR扩增，并产生许多未知大小的DNA片段；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离组成RAPD带型。RAPD带型的区分依赖于电泳条带的数量和大小，遗传上不相关的菌株带型差异较大。

RAPD的缺点是重复性不高，难以实现结果比较。然而RAPD分型技术不需要获知待测物种准确的基因组序列信息，具有较高的灵敏度和特异度[15]，并且该方法简单快速、成本较低，因此被广泛应用于念珠菌及其他真菌的基因分型中[16-17]。Wu等[16]利用25S rDNA和RAPD分别对分离于牙齿的40株白念珠菌进行了分型，结果显示，25S rDNA将40株分离株分为3个基因型，而RAPD分为5个基因型，证明RAPD是可靠全面的分型方法。此外，有研究者认为分别使用不同随机引物进行RAPD分型，并组成复合图谱，可以提高RAPD的分辨力。

3.3 PCR解链曲线图形（PCR melting profle，PCR MP）

DNA测序表明：在GC含量上，基因组DNA片段表现出大量的异质性。限制性内切酶消化后的基因组DNA片段的解链温度依赖于这些片段的长度和GC含量。也就是说，消化后的基因组DNA热稳定性是存在差异的。PCR MP最初用于大肠埃希菌的临床菌种分型，2009年首次用于白念珠菌的基因分型。

PCR MP是一种新型基因分型方法，目前在念珠菌中应用不多[18-19]。2014年，Golas等[18]利用PCR MP将115株光滑念珠菌分为52个不同带型，确认了PCR MP对于区分光滑念珠菌种内遗传关联的有用性。PCR MP分型的优点是DNA用量少，操作简易，重复性好，结果简单易于分析，并且对DNA完整性和实验设备要求不高，是一种快速、经济的分型方法，尤其适合于临床重要真菌短期流行病学研究。然而，PCR MP的分辨力与选用的限制酶和Taq酶有关，同时对PCR扩增的变性温度和退火温度较为敏感，因而对反应条件的优化必不可少，选择合适的限制酶和Taq酶尤为重要。

4 小结与展望

念珠菌分型是念珠菌流行病学和种群结构研究的有用工具，种群结构的研究有利于抗真菌药和治疗方案的选择。MLP和MLST作为准确DNA依赖的分型方法，产生的结果精确、分辨力高、重复性好，并且可建立数据库。相对于其他分型方法，MLP和MLST更适合于全球范围内的流行病学研究。新兴分型方法MALDI-TOF MS虽然需要质谱仪，但其通量大，结果简单，耗时短；PCR MP分辨力中等，介于RAPD和MLST之间，是一种新兴的、快速简易、结果简单、经济灵敏的中通量分型方法。这两种分型方法更适合于临床实验室已知菌株临床流行病学的大规模调查研究。PFGE、RFLP和RAPD等分型方法不需要获知待测菌株的具体遗传信息，对于临床上未知菌株的分类鉴定和种群结构研究较为适合。因此，合适的分型方法应根据实际情况（如研究目的、实验条件等）进行选择。

目前，相关研究者常常结合多种分型方法进行对比研究，如将基因分型方法和表型分型方法（如耐药性、毒性等）结合，研究不同表型菌株的种群结构和微进化关系等。在念珠菌分型研究中，未来的10年内这种结合多种分型方法对比研究的趋势可能将更加明显；另外，先使用一种分辨力较低或中等的分型方法（如RAPD、ABC分型、PCR 25S rDNA和PCR MP等）进行粗略分型，然后使用准确性更高的分型方法（如MLP和MLST等）对前者难以区分的遗传密切相关菌株进行精确分型。这样结合不同分型方法，不但可以减少工作量和实验费用，而且同样可以达到较为理想的菌株分型目的。此外，随着测序技术的不断发展，未来测序费用降低，届时基于完整基因组比对的基因分型或将成为临床念珠菌分型的常规方法。

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Research updates on the typing of Candida

XIANG Guoshi, CHENG Xi, HUANG Xiaotian. （Department of Medical Microbiology, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China）

R379.4

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0215-04

10.16718/j.1009-7708.2017.02.020

2016-02-23

2016-03-16

国家自然科学基金（81160196, 8460300），江西省青年科学家培养项目（20133BCB23005），江西省科学技术项目（20142BAB215053）联合资助。

南昌大学医学部微生物学教研室，南昌 330006。

项国仕（1990—），男，硕士研究生，主要从事病原微生物研究。

黄孝天，E-mail：xthuang@ncu.edu.cn。