蓬子菜有效成分对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症损伤的保护作用

宁馨，董坤，孙超，马英丽

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)



蓬子菜有效成分对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症损伤的保护作用

宁馨，董坤，孙超，马英丽*

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究蓬子菜中总黄酮和木犀草苷对脂多糖(LPS)诱导的脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症损伤的保护作用。方法：以HUVEC为研究对象，用CCK-8检测总黄酮及木犀草苷对HUVEC增殖的影响；采用流式细胞仪检测不同浓度LPS对HUVEC细胞周期的影响；酶联免疫分析法检测总黄酮及木犀草苷对LPS诱导的HUVEC炎症因子生成的影响；实时定量PCR法检测HUVEC中P-选择素E-选择素 mRNA水平。Western blot法测NF-κB，P-IκB蛋白表达。结果：药物浓度在6.25、12.5、25 μg/mL时细胞增殖率最大；总黄酮及木犀草苷能明显下调LPS诱导的炎症因子和黏附分子的分泌，同时也降低了P-选择素E-选择素的表达，NF-κB，P-IκB蛋白表达量。结论：LPS对HUVEC有抑制作用呈剂量、时间依赖性，给予总黄酮和木犀草苷后，损伤有明显改善。

蓬子菜总黄酮；木犀草苷；炎症；脐静脉内皮细胞；脂多糖

蓬子菜(GaliumverumL.)为茜草科猪秧秧属植物蓬子菜的地上部分。现代药理实验证明蓬子菜具有解热、镇痛、抗炎和抗脂质过氧化等作用；还可降低血液黏滞度,抑制血小板聚集,从而减少微循环疲滞的状况，改善血液循环。其主要化学成份为黄酮、蒽醌、环西醚萜类及有机酸等[1]。吕勃川等应用康脉II号对31例下肢深静脉血栓患者治疗并进行临床观察,发现其可以有效治疗下肢深静脉血栓患者,临床总有效率达93.54%[2]。康脉II号中就含有被广泛使用的蓬子菜。

在1976年首先由著名学者Ross[3]提出，认为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的病理变化过程，主要经由炎症反应介导，并伴有氧化应激的发生。目前得到广泛认可的发病机制是以脂质浸润学说和损伤反应学说为基础的炎症理论[4]。有体内研究表明，蓬子菜总黄酮不仅能够降低血流阻力，改善血液循环，并且能够改善血瘀证血液高凝黏的状态，对心血管疾病导致的氧化损伤及炎症反应有很好的保护和治疗作用[5]。蓬子菜在民间广泛应用，但关于蓬子菜有效成分体外抗炎作用的研究较少，本研究以蓬子菜为原料，进一步深入蓬子菜中有效成分对人脐静脉内皮细胞炎症损伤保护作用的研究。

1 材料和方法

1.1 主要药物与试剂

总黄酮及木犀草苷由蓬子菜干燥地上部分提取分离纯化而成；RPMI-1640培养液、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone公司)；青霉素、链霉素(碧云天公司)；二甲基亚砜(DMSO)、脂多糖(LPS)(Sigma公司)；CCK-8试剂(日本同仁公司)；PI双染试剂盒(碧云天公司)；ICAM-1，VCAM，IL-6，IL-8 ELISA试剂盒(欣博盛公司)；TNF-α，IL-1β试剂盒(B&D公司)；逆转录试剂盒(美国Promega公司)；过硫酸胺(APS)、TEMED、琼脂糖粉(美国Sigma公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；Trizol Reagent RNA抽提试剂(美国Invitrogen公司)。

1.2 仪器

CO2恒温培养箱(Heal Force公司)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；Synergy2酶标仪(美国BioTek公司)；流式细胞仪(BD公司)；离心机(日本TOMY，MX-307)；低温冰箱(英国Thermo公司)；荧光定量PCR仪(美国stratagene公司)；SDSPAGE微型凝胶电泳议(美国Bio-Rad公司)。

1.3 细胞株

人脐静脉内皮细胞购自南京凯基生物技术有限公司，使用胰蛋白酶-EDTA消化液传代，在含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中置于培养箱(37℃，5%CO2)常规培养。

2 实验方法

2.1 CCK-8法检测总黄酮和木犀草苷对HUVECs增殖的影响

取对数生长期的HUVEC细胞，以每孔2×104个/mL密度接种于96孔板，每孔加入200 μL,贴壁12 h，分别给予不同浓度总黄酮(3.125，6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL)和木犀草苷(3.125，6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL)，分别作用24 h，48 h，72 h。每孔加入20 μL CCK-8试剂，混匀，37℃培养1.5 h，使用全自动酶标仪于490 nm测定OD值。

2.2 LPS诱导的炎症模型的建立

取对数生长期的HUVEC细胞，以每孔2×104个/mL密度接种于96孔板，每孔加入200 μL,贴壁12 h，分别给予不同浓度LPS(0，1，5，10，20，50，100，200 μg/mL)，每组三个复孔，经过4 h，24 h，48 h的损伤，同上采用CCK-8法测OD值。

2.3 流式细胞技术检测LPS对细胞周期的影响

取对数生长期的HUVEC细胞以每孔105个/mL密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL，贴壁12 h。分空白对照组和模型组，模型组给于10 μg/mL LPS，继续培养24 h。胰蛋白酶消化收集细胞，离心弃上清，以4℃预冷的70%乙醇固定过夜后，PBS洗涤1次，加入碘化丙啶染色液1 mL，37℃避光孵育30 min，用流式细胞仪在发射波长620 nm处检测各组细胞红色荧光。

2.4 酶联免疫分析法检测炎症因子的表达水平

取对数期的HUVEC细胞，按104个/ml的密度接种于96孔板中，培养12 h使细胞贴壁，实验分为八组(总黄酮高中低剂量组，木犀草苷高中低剂量组，模型组，空白对照组)，每组三个复孔，先给药培养24 h后，除空白对照组外其他组给于10 μg/mL LPS，继续培养24 h。取细胞上清液按照试剂盒说明书进行炎症因子的含量检测。

2.5 PCR测P-选择素，E-选择素mRNA的表达

收集各组细胞，加入1 mL Trizol提取总RNA，使用反转录试剂盒讲总RNA逆转录为cDNA。PCR扩增，引物序列及PCR产物长度见表1，PCR反应条件为95℃，3 min变性；在进行94℃，20 s，62℃，40 s循环扩增，共40个循环。

2.6 Western blot法测NF-κB蛋白表达

收集各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)使用说明操作,测定蛋白浓度。配制分离胶，上样跑胶。将PVDF膜放入甲醇中浸泡使用，将海绵垫，滤纸，分离胶，PVDF膜按顺序放好，然后插入转膜电槽。用Blocking buffer封闭转印膜。分别进行一抗二抗孵育，最后显色曝光，分析结果。

表1 引物序列及PCR产物长度

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 总黄酮和木犀草苷对细胞增殖的影响

如表2、图1，给药组在6.25，12.5，25 μg/mL浓度的增殖率显著高于空白组(P<0.01)，浓度为400 μg/mL的药物明显抑制细胞生长，72 h抑制作用明显大于48 h大于24 h,因此选取6.25，12.5，25 μg/mL为低、中、高给药剂量。

表2 CCK-8法检测总黄酮和木犀草苷对细胞增殖

注:与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Figure.1 the data of the OD of the inflammation factors

3.2 LPS诱导的炎症模型的建立

与对照组相比模型组的增殖率明显低于对照组(P<0.01)，随浓度的增加，其对细胞增殖的抑制程度也逐渐增强(P<0.01)抑制作用存在浓度依赖性。倒置显微镜观察结果显示：未经LPS处理的对照组HUVEC 细胞拥簇成团贴壁生长，呈鹅卵石样镶嵌排列，细胞质丰富，细胞核清晰，细胞伸展性良好，边界清晰。LPS处理后 HUVEC 细胞形态发生改变，细胞呈现不规则状，细胞质变得浑浊，细胞突起伸长，细胞间距增宽。参考实验结果与文献最终选定炎症损伤浓度为10 μg/mL LPS，损伤时间为24 h。见表3。

表3 CCK-8法检测LPS对细胞增殖的影响

注:与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 流式细胞技术检测LPS对细胞周期的影响

如图2为空白组细胞周期情况，图3为模型组细胞周期情况，与空白组相比，LPS 10 μg/mL组G1期比例明显高于对照组，S期细胞与空白组比较明显减少。LPS使HUVEC滞留在G1期。

Figure.2 the result of the control group

Figure.3 the result of the model group

G1(%)G2(%)S(%)空白组32.561.0866.36模型组46.012.9551.04

3.4 酶联免疫分析法检测炎症因子的表达水平

结果见表5，模型组与空白对照组比较，细胞上清液中的IL-6，IL-8，ICAM-1，TNF-α都明显增高(P<0.05，P<0.01)高剂量组的治疗作用明显优于中、低剂量组，总黄酮组作用优于木犀草苷组，说明药物对LPS诱导的炎症损伤有良好的保护作用。

表5 ELISA法检测细胞因子含量比较

注:与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05;与空白组比较，△△P<0.01，△P<0.05。

3.5 PCR测P-选择素，E-选择素mRNA的表达

表4，5结果表明，空白对照组中HUVEC细胞的P-选择素，E-选择素mRNA的相对表达很低，而LPS明显上调了选择素的相对表达量，给药组选择素mRNA表达均下降，高剂量组的基因表达显著下降。

Figure.4 relative expression of the select-E

Figure.5 relative expression of the select-P

3.6 Western blot法测NF-κB蛋白表达

如图6，7，与对照组比较，LPS模型组的NF-κB P65，P-IκB蛋白表达条带颜色加深，具有统计学差异(P<0.05)。从数据可以看出，总黄酮低中高剂量组能明显降低LPS损伤后的NF-κB P65，P-IκB1蛋白表达量的上调，成剂量依赖性，在25 μg/mL时达到顶峰。木犀草苷高中低剂量组也能明显降低蛋白表达量，但是和总黄酮高中低剂量组比较，没有总黄酮组作用效果明显。

Figure.6 NF-KB P65注：图从左到右共有8条带，依次为：1：空白对照组；2：LPS 10 μg/mL；3：总黄酮25 μg/mL；4：总黄酮12.5 μg/mL；5：总黄酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

Figure.7 GAPDH

注：图从左到右共有8条带，依次为：1：空白对照组；2：LPS 10 μg/mL；3：总黄酮25 μg/mL；4：总黄酮12.5 μg/mL；5：总黄酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

Figure.8 p-IKBα注：图从左到右共有8条带，依次为：1：空白对照组；2：LPS 10 μg/mL；3：总黄酮25 μg/mL；4：总黄酮12.5 μg/mL；5：总黄酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

组别(μg/mL)GAPDHNF-KBP65NF-KBP65/GAPDHratetoK无血清空白14840003893760.26240.3675LPS1013153339389570.71391总黄酮2515703334909360.31260.4379总黄酮12.514636666296690.43020.6026总黄酮6.2515536668417440.54180.7589木犀草苷2515703335022670.31980.4481木犀草苷12.513920006842530.49160.6886木犀草苷6.2513240007554640.57060.7993

Figure.9 GAPDH

注：图从左到右共有8条带，依次为：1：空白对照组；2：LPS 10 μg/mL；3：总黄酮25 μg/mL；4：总黄酮12.5 μg/mL；5：总黄酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

表7 p-IκBα蛋白表达结果(n=3)

4 讨论

下肢深静脉血栓(DVT)形成是常见的周围血管疾病,中医古典医学著作将本病归于“脉痹”“血疲证”“肿胀”“疲血流注”等范畴[6-7]。DVT发生是一个多因素参与的复杂过程，随着对血栓性疾病的深入研究,特别是对细胞分子水平的研究,除了Vierhow[8]静脉血栓发病三大因素外,还发现炎症反应与血栓形成有密切的关系。血管细胞的功能紊乱和炎症反应是其发生的重要诱因。正常静脉内皮具有抗血栓形成的功能,但在静脉损伤情况下或静脉内环境发生混乱时,可转化为血栓前状态,产生细胞因子,增加静脉内皮渗透性,诱导细胞黏附,炎症因子的表达如IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF-α)等。

LPS(脂多糖,也称内毒素)[9-10]是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分，是诱导内皮细胞炎症反应和功能紊乱的重要因素之一。本实验采用LPS诱导HUVEC细胞，成功建立了细胞炎症损伤模型，结果表明LPS 可以抑制内皮细胞生长，并诱导内皮细胞表达炎症细胞因子和黏附分子等，影响细胞生长周期，使细胞周期滞留在G1期。总黄酮和木犀草苷低中高剂量能够使HUVEC增殖，有效抑制LPS对HUVEC细胞增殖的影响，能够明显降低细胞内炎症因子IL-6，IL-8，TNF-α，VCAM-1等的含量，降低通路蛋白的表达，对LPS导致的炎症反应有很好的保护作用。

源于蓬子菜中的总黄酮组分和木犀草苷单体对炎症损伤的作用为高剂量组优于中剂量组优于低剂量组，总黄酮组优于木犀草苷组，此结果可能是由于总黄酮组能有效抑制炎症反应发生的多个通路。本实验结果证明蓬子菜中成分对深静脉血栓的前期炎症反应有保护作用，这也为进一步阐明蓬子菜治疗血栓的分子机制奠定基础。

[1] 赵春超,邵建华.蓬子菜的化学成分[J].沈阳药科大学学报,2009,26(11):904-906.

[2] 马英丽,卢卫红,等.蓬子菜的化学成分研究(Ⅰ)[J].中草药,2005,36(10):1464-1466.

[3] 吕勃川.康脉Ⅱ号胶囊治疗下肢深静脉血栓形成患者的临床疗效与分子机制研究[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学,2014.

[4] 张娜,李林森.炎症与动脉粥样硬化的新认识及有关中药的研究进展[J].药物评价研究,2013,36(4):302-306.

[5] 寇韩旭,董坤.蓬子菜总黄酮对急性血瘀大鼠血液流变学影响及作用机制的研究[J].中医药学报,2015,43(1):11-15.

[6] 万晓晨，董坤，寇韩旭，等.蓬子菜中香叶木苷抗血栓形成作用的实验研究[J].中医药信息，2014,31(6):4-7.

[7] 吕勃川，夏联恒，李令根，等.康脉2号胶囊治疗下肢深静脉血栓形成31例疗效观察[J].中医药信息，2014,31(3):128-130.

[8] Emmerich J.Mechanisms and risk factors of venous thromboembolic disease[J].Rev Prat,1996,46(10):1203-10.

[9] Garcia IJ,Kinoshita PF.Ouabain Modulates the Lipid Composition of Hippocampal Plasma Membranes from Rats with LPS-induced Neuroinflammation[J].J Membr Biol,2015,248(6):1191-8.

[10] 曹春琪，赵跃东，张旗，等.麦冬不同提取部位对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响[J].中医药信息，2016,33(2):11-15.

Protective Effect of Active Compound from Galium verum L. on HUVEC Inflammatory Injury Induced by LPS

NING Xin, DONG Kun, SUN Chao, MA Ying-li*

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To observe the protective effect of galuteotin and flavonoids from Galium verum L. on HUVEC inflammatory injury induced by LPS. Methods: The method called CCK-8 was used to detect the influence of drugs on the proliferation of HUVEC. The influences of different LPS concentrations on the cell cycle were compared by FCM (flow cytometry). Use ELISA to detect the influence of LPS on the generation of inflammation factor after giving drugs. The expression levels of E-selection and P-selection mRNA were measured by RT-PCR. Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB, p-Iκ-B. Results: When the concentrations of drugs were 6.25, 12.5, 25 μg/mL respectively, the proliferation rate was the best. The drugs had an obvious effect on decreasing the secretion of the inflammation factor in the HUVEC induced by LPS. Meanwhile,they could decrease the relative expression of E-selection and P-selection and the protein expression of NF-κB, P-IκB. Conclusion: The inhibitive effect of LPS presents time-dependence and dose-dependence. The injury is obviously improved after giving galuteotin and flavonoids from Galium verum L.

Flavone of Galium verum L; Galuteotin; Inflammation; Human umbilical endothelial cells; Lipopolysacharide

国家自然科学基金项目(No．201281274034)； 教育部博士点博导类基金资助项目(No.20112327110006)

宁馨(1990-)，女，研究生，主要研究方向：中药及复方药效物质基础。

马英丽*(1954-)，女，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药及复方药效物质基础,质量标准化研究。

2016-05-20

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0017-05

修回日期：2016-06-10