3种针法对PCPA诱导的失眠大鼠海马5-HT1A、5-HT2A蛋白表达的影响*

罗本华， 陈周婧， 王 燕， 张亚飞， 郭雅雯

广西中医药大学针灸推拿学院，南宁 530001



实验研究

3种针法对PCPA诱导的失眠大鼠海马5-HT1A、5-HT2A蛋白表达的影响*

罗本华， 陈周婧， 王 燕， 张亚飞， 郭雅雯

广西中医药大学针灸推拿学院，南宁 530001

目的 观察针刺失眠方、脐内环穴及失眠方加脐内环穴对对氯苯丙氨酸(PCPA)失眠大鼠海马5-HT1A、5-HT2A蛋白表达的影响。方法 将造模成功的30只PCPA失眠大鼠随机分为5组(每组6只)：模型组、针刺失眠方组、针刺脐内环穴组、针刺失眠方加脐内环穴组、针刺非穴组；另设正常组(6只)。治疗6 d后取大鼠海马匀浆，采用免疫印迹法检测5-HT1A、5-HT2A蛋白含量。结果 PCPA模型大鼠海马5-HT1A蛋白表达下降，而5-HT2A蛋白表达上调；3种针法均显著上调PCPA失眠大鼠海马5-HT1A蛋白表达、下调5-HT2A蛋白表达；而失眠方加脐内环穴针刺作用更明显，优于单一针刺方法。结论 PCPA失眠大鼠存在中枢5-HT受体信号机制异常，3种针法可能通过调节海马内5-HT1A、5-HT2A蛋白表达而改善失眠；实验支持失眠方加脐内环穴针刺为失眠症的优选干预方法。

失眠； 脐内环针； 失眠方； 5-HT1A； 5-HT2A

5-羟色胺(5-HT)在睡眠调节过程中起着重要的作用，是失眠症发病的公认机制之一，然而其中关于5-HT跨膜信号转导机制仍不是很明确，目前研究也相对较少。针刺失眠方[1]、脐内环穴[2]针刺是流行于广西地域的治疗失眠症临床有效的针刺验方；笔者常将二者结合用于失眠症治疗，取得更好疗效[3-4]。为了解其对睡眠活动的调节机制，探讨3种针刺方法的差异，本实验研究3种针刺对对氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)失眠模型大鼠海马5-HT1A、5-HT2A蛋白表达的影响，旨在探讨失眠症中5-HT跨膜信号转导机制，并为该针刺方法在失眠症的临床运用、方法优选提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物 健康SPF级Wistar雄性大鼠46只，体重(250±15)g，由广西医科大学动物实验中心提供；室温20～25℃饲养，室内采光按照白昼循环模式，定时喂食，自由饮水，适应性喂养15 d。

1.1.2 试剂 PCPA试剂盒(Alfa Aesar公司，H30Y014)；BCA法蛋白定量试剂盒(上海生工生物工程有限公司,SK3021)，Anti-5-HT1ARat Monoclonal Antibody(Abcam公司，ab85615)，Anti-5-HT2ARat Monoclonal Antibody(Abcam公司，ab66049)，辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L)(碧云天公司,A0192)，Aprotinin(北京中杉金桥生物技术有限公司)；蛋白酶抑制剂Cocktail(北京泛基诺生物技术有限公司)。

1.1.3 仪器 低温高速离心机(Sigma公司,SIGMA3-18K)，ELX800酶标仪(BIO-TEK)，UVP凝胶成像系统(Thermo公司，CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 System)，电泳仪系统(北京六一仪器厂，DYCZ-24 DN)，半干转膜仪系统(ATTO)，匀浆仪(FLUKO-PRO200)，PVDF膜(Millipore公司,0.22 μm孔径)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 采用随机数字表法将46只Wistar大鼠随机分为正常组6只、拟造模大鼠40只。拟造模大鼠在造模成功后筛选出30只，按随机数字表法分为模型组、针刺失眠方组、脐内环针组、失眠方加脐内环针组、非穴组等5组，每组各6只。

1.2.2 PCPA失眠模型制作 PCPA临用前用弱碱性生理盐水(pH7～8)配置成45 mg/mL混悬液备用。于上午8：00左右将大鼠按l mL/100 g体重腹腔注射PCPA混悬液，1次/d，连续注射2 d，在第2次腹腔注射PCPA 28～30 h后，动物出现昼夜节律消失，白天活动不停，整体观察与正常组有明显不同者，表明模型复制成功。正常组腹腔注射相同体积的弱碱性生理盐水。

1.2.3 针刺干预方法及疗程 6组于造模成功次日开始实验干预治疗，1次/d，共6次。

①正常组与模型组：不予任何治疗，只给予同脐内环针组相同时间(4 min)及相同强度的抓摸刺激。

②针刺失眠方组：给予针刺失眠方穴治疗。取穴[5]：双侧神门、支沟、足三里、三阴交。大鼠的神门在前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，直刺1 mm；三阴交在后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm；足三里即后三里，在膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，直刺7 mm；支沟穴在前肢外侧，距腕关节4.5 mm左右的尺桡骨间，直刺1 mm。针刺方法以25 mm×13 mm粗细的毫针，刺入穴位相应的深度，针后行捻转角度90°以内90～180次/min的高频小幅度捻转手法，每穴行30 s后出针，每次共治疗4 min。

③脐内环针组：给予针刺脐内环穴治疗。取穴：脐内环穴，取心肝脾肺肾六穴点。脐内环穴在大鼠神阙穴[5]旁开2.5 mm处作一圆环，环线上均是穴位(据上书神阙至中脘约20 mm折算)；以正上方为心，正下方为肾，右为肝，左为脾胃，左上、右上均为肺，共6个穴点。针刺方法以25 mm×13 mm粗细的毫针，由内向外以10～15°刺入2～4 mm，针后不行捻转提插手法，每穴点留针30 s，共3 min；继续抓摸1 min，每次共治疗4 min。

④失眠方加脐内环针组：给予以上失眠方针刺加脐内环针刺治疗，每穴行30 s后出针，共治疗7 min。

⑤非穴组：针刺双侧肋下各两个固定非穴点[6]，约相当于乳正中线外开2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；每穴行90 s后出针，继续抓摸1 min，每次共4 min。

1.2.4 大鼠海马取材方法 针灸干预方案完成后第2天，处死各组动物，开颅迅速取出整脑，冰上分离各组大鼠海马，冷生理盐水中洗去血液，电子天平上称重待检。

1.2.5 大鼠海马5-HT1A、5-HT2A蛋白表达检测 采用免疫印迹法检测5-HT1A、5-HT2A蛋白含量，主要步骤如下：①大鼠迅速断头后，分离新鲜海马组织，加适量蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上研磨、匀浆，静置60 min，匀浆液12 000 g 4℃离心10 min；吸取上清液分装，-80℃保存备用；②检测时，取冻融蛋白标本，采用BCA法测定蛋白质浓度；③取样本20 μL，总蛋白量约50 μg，SDS聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳；④半干转法转膜；⑤0.5%脱脂牛奶TBST溶剂封闭；⑥一抗孵育；⑦辣根过氧化物酶二抗孵育；⑧洗净的膜浸泡在ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HEP Substrate混和液1 mL中约30～60 s，在凝胶成像分析仪选用化学发光法进行显色，保存图片或将膜拍照，用Quantity One 4.3.1软件(Bio-Rad Laboratories)检测各组目标条带的灰度值，以目标条带与内参β-actin灰度值的比值表示目标蛋白的表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠海马5-HT1A蛋白的表达

大鼠海马5-HT1A/β-actin蛋白相对表达量各组如下：正常组为(0.756±0.058)，模型组为(0.356±0.070)，针刺失眠方组为(0.494±0.049)，脐内环针组为(0.570±0.032)，失眠方加脐内环针组为(0.739±0.055)，非穴组为(0.377±0.060)；经单因素方差分析得F=58.547，P<0.01，提示组间差异有统计学意义。两两比较结果显示：模型组PCPA失眠大鼠海马5-HT1A蛋白相对表达量显著低于正常组大鼠(P<0.01)，而与非穴组之间差异无统计学意义；针刺失眠方组、脐内环针组及失眠方加脐内环针组5-HT1A蛋白相对表达量均显著高于模型组大鼠(均P<0.01)；失眠方加脐内环针组5-HT1A蛋白相对表达量均显著高于其他针刺组(均P<0.01)，而与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

A：正常组；B：模型组；C：针刺失眠方组；D：脐内环针组；E：失眠方加脐内环针刺组；F：非穴组；阳性：标准蛋白组的蛋白印迹；5-HT1A蛋白分子量约46 kD；与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.01；与失眠方加脐内环针组比较，* P<0.01图1 各组大鼠5-HT1A蛋白的表达Fig.1 Expression of 5-HT1A protein in each group

2.2 各组大鼠海马5-HT2A蛋白的表达

大鼠海马5-HT2A/β-actin蛋白相对表达量各组如下：正常组为(0.195±0.044)，模型组为(0.617±0.089)，针刺失眠方组为(0.446±0.081)，脐内环针组为(0.406±0.068)，失眠方加脐内环针刺组为(0.224±0.045)，非穴组为(0.594±0.088)；经单因素方差分析得F=37.098，P<0.01，提示组间比较差异有统计学意义。两两比较结果显示：模型组PCPA失眠大鼠海马5-HT2A蛋白相对表达量显著高于正常组大鼠(P<0.01)，而与非穴组之间差异无统计学意义；针刺失眠方组、脐内环针组及失眠方加脐内环针组5-HT2A蛋白相对表达量均显著低于模型组大鼠(均P<0.01)；失眠方加脐内环针组5-HT2A蛋白相对表达量均显著低于其他针刺组(均P<0.01)，而与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

A：正常组；B：模型组；C：针刺失眠方组；D：脐内环针组；E：失眠方加脐内环针刺组；F：非穴组；阳性：标准蛋白组的蛋白印迹；5-HT2A蛋白分子量约55 kD；与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.01；与失眠方加脐内环针组比较，* P<0.01图2 各组大鼠5-HT2A蛋白的表达Fig.2 Expression of 5-HT2A protein in each group

3 讨论

中医认为失眠的病机关键为水火失调，阴阳失衡。失眠穴方是治疗失眠症的针刺验方，主穴为神门、支沟、足三里、三阴交，立意泻火补水，是针对失眠水火失调病机而设。脐内环针是壮医针刺的基础针法和调气方法，而脐内环穴五脏点同取法是壮医针刺颇具疗效和研究基础的失眠效方；究其理，脐内环穴位于脐旁开0.5寸，能沟通任冲和调节先天后天；脐是机体三部人部所在，是脏腑信息全息处，结合针向迎随，能调理全身脏腑和气血；脐通五脏之神、善调五脏之气，又起最基本的调气调神作用；因而，针刺脐内环穴能整体调理脏腑阴阳气血神气，广泛用于全身诸多疾病的整体调理。数年来，笔者验证了单用脐内环五脏点同取法和失眠穴方针刺治疗失眠症的疗效，而发现二者结合针刺疗效更优，该法既能有效地发挥脐内环针整体治神调气和近部脏腑调节的作用，又发挥失眠穴方肢体经穴的远治作用，更整体而全面地顾及失眠症的脏腑经络调节、水火阴阳平衡。前期我们关于大鼠神经行为学实验证实：PCPA失眠大鼠存在全面的认知功能障碍，脐内环穴针刺和失眠穴方针刺均一定程度改善了PCPA失眠大鼠认知功能障碍，作用与安定药物相当；而脐内环合失眠穴方针法起全面改善PCPA失眠大鼠认知功能障碍作用，明显优于安定药物，为3种针法中的优选干预方法[7]。

睡眠发生与睡眠-觉醒机制相关的中枢神经递质含量发生改变密切相关[8]。5-HT是公认的参与睡眠-觉醒机制的神经递质，对慢波睡眠的发生和维持起着重要作用，是脑内的“致眠因子”[9]，故中枢5-HT递质改变是失眠障碍发病的公认机制之一。5-HT作用通过与其相应受体结合，实现神经信息传递和信号转导功能，发挥其应有的生物学作用，反映其在睡眠机制中的生理功能和病理机制；5-HT1A、5-HT2A是目前研究较多的与睡眠-觉醒的调节关系较密切的5-HT受体亚型；5-HT1A受体在脑内海马、中缝核有较多分布，激活该受体可缓解焦虑症状，影响大脑的唤醒、情绪等功能，一般低剂量的5-HT1A激动剂可增加深睡眠和浅睡眠[10]。激动5-HT2A可抑制漫波睡眠、引起觉醒增加[11]。许峰[12]发现腹腔注射PCPA的失眠大鼠，正常睡眠消失，大鼠下丘脑及海马内的5-HT含量降低，5-HT1A表达减弱，5-HT2A表达增强，提示“熟眠方”可能是通过影响下丘脑及海马内5-HT1A、5-HT2A表达引起下丘脑及海马内5-HT含量的改变，从而起到治疗失眠的作用。脑内5-HT1A、5-HT2A是中枢5-HT神经递质信号的直接下游，是直接反映中枢5-HT睡眠调节功能的指标之一。PCPA是5-HT合成抑制剂，腹腔注射PCPA能造成睡眠昼夜节律消失，达到完全失眠，故PCPA失眠大鼠模型是目前公认的、广泛用于失眠症中枢5-HT递质研究的经典动物模型。中枢5-HT能神经元胞体大部分位于网状结构的中缝核群，其纤维投射到丘脑、下丘脑、海马、基底神经节和大脑皮层。海马在睡眠-觉醒的调节中起重要作用[13]。本实验中模型组大鼠海马5-HT1A含量较正常组大鼠显著降低、5-HT2A含量较正常组大鼠显著升高，说明PCPA失眠大鼠模型不仅存在中枢5-HT含量的降低，而且其下游的5-HT1A、5-HT2A表达也存在异常；而针刺失眠穴方、脐内环针刺和二者结合针刺均显示有上调PCPA失眠大鼠海马5-HT1A蛋白表达以及下调5-HT2A蛋白表达的作用，从而恢复PCPA所致失眠大鼠的睡眠-觉醒周期，提示该3种针法均对失眠症有效，都与中枢突触5-HT递质信号后的受体信息转导机制有关；而二者结合针法显示了明确的叠加作用，优于单一针刺方法；结合前期神经行为实验[7]，本实验进一步支持其为失眠症治疗的优选方法。

综上，PCPA失眠模型大鼠存在中枢突触5-HT递质信号后的受体信息机制异常，3种针法均可能通过上调PCPA失眠大鼠海马5-HT1A蛋白表达、下调5-HT2A蛋白表达，从而恢复PCPA所致失眠大鼠的睡眠-觉醒周期，起到调治失眠的作用；实验支持针刺失眠穴方加脐内环穴方法为失眠症优选干预方法。

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(2016-06-22 收稿)

Effect of Three Kinds of Acupuncture on Protein Expression of 5-HT1Aand 5-HT2Ain Hippocampus of Para-chlorophenylalanine-induced Insomnia Rats

Luo Benhua，Chen Zhoujing，Wang Yanetal

FacultyofAcupunctureandMassageofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanning530001，China

Objective To observe the effects of three kinds of acupuncture (the acupoint-prescription of insomnia，acupuncture of umbilical inner acupoints，combined method of acupoint-prescription of insomnia and acupuncture of umbilical inner acupoints)on the protein expression of 5-HT1Aand 5-HT2Ain hippocampus of para-chlorophenylalanine(PCPA)-induced insomnia rat model，and to select the optimal acupuncture method.Methods Totally，30 PCPA-induced insomnia male rats were randomly divided into five groups，and there was still another normal group(6 of each group).The normal group and the model group were given no special treatment；the three observation groups received acupuncture treatment of the umbilical inner acupoints，the acupoint-prescription of insomnia，and the combined method，respectively.The non-acupoint group was treated with acupuncture on non-acupoint.After six days of treatment，in the hippocampus homogenates of the rats，the protein expression levels of 5-HT1Aand 5-HT2Awere detected by Western blotting.Results The protein expression level of 5-HT1Ain hippocampus of PCPA-induced insomnia rats was significantly reduced，and that of 5-HT2Awas significantly elevated.Three acupuncture methods can improve the protein expression level of 5-HT1Aand reduce the protein expression level of 5-HT2Ain hippocampus of rats.The combined method displayed a more significant effect in increasing or reducing the protein expression levels than each single method of acupuncture.Conclusion In PCPA-induced insomnia rats，5-HT receptor signal in central nervous system is abnormal；the three kinds of acupuncture methods might take effects on insomnia by improving the protein expression level of 5-HT1Aand reducing the protein expression level of 5-HT2Ain hippocampus.The combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription therefore is the preferred acupuncture method.

primary insomnia； the acupuncture of umbilical inner acupoints； the acupoint-prescription of insomnia； 5-HT1A； 5-HT2A

*广西自然科学基金资助项目(No.2013 GXNSFAA019133)

R749.052

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.016

罗本华，男，1968年生，主任医师，医学博士，E-mail：luobenhua1968@163.com