应用ARMS-PNA技术检测晚期肺腺癌患者血浆中EGFR基因突变*

闵生萍， 刘 安， 洪 磊， 王效静

安徽呼吸系病临床基础省级实验室，蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，蚌埠 233000



应用ARMS-PNA技术检测晚期肺腺癌患者血浆中EGFR基因突变*

闵生萍， 刘 安， 洪 磊， 王效静△

安徽呼吸系病临床基础省级实验室，蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，蚌埠 233000

目的 检测肺腺癌患者的血浆和组织/恶性胸腔积液样本中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况，探讨血浆样本在EGFR基因检测中的应用价值。方法 收集200例Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌患者的组织/恶性胸腔积液及其相对应的血浆样本，利用扩增受阻突变体系联合肽核酸(amplification refractory mutation system-peptide nucleic acids，ARMS-PNA)技术检测EGFR基因突变情况。结果 组织/恶性胸腔积液样本中EGFR基因的阳性率(46.00%)明显高于血浆样本(33.00%)，两者之间差异具有统计学意义；与组织/恶性胸腔积液样本相比，血浆EGFR基因突变检测的灵敏度为71.73%，特异度为100.00%，总符合率为87.00%；Ⅳ期肺腺癌患者的血浆EGFR基因突变检测灵敏度(76.92%)明显高于Ⅲ期(65.00 %)。结论 与晚期肺腺癌组织/恶性胸腔积液相比，血浆EGFR突变检测具有高度的特异度，但灵敏度相对较低。当肿瘤组织/恶性胸腔积液难以获取时，血浆可以作为EGFR基因突变检测的合适样本。

表皮生长因子受体； 肺腺癌； 血浆； ARMS-PNA技术

由于缺乏行之有效的肺癌早期诊断/筛查体系，大部分非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)患者在首诊时已经处于中、晚期，错过了手术治疗的最佳时期，仅可进行姑息性放、化疗[1]。尽管放、化疗在一定程度上可以延长患者生存期，但其疗效有限，加之其比较严重的毒副作用，导致NSCLC患者治疗效果不理想[2]。随着药物基因组学的发展和对肺癌发病分子机制的深入认识，针对特定肿瘤细胞或分子的靶向药物的研发为NSCLC患者带来了曙光。

临床研究已经证实，以吉非替尼等为代表的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂类(EGFR-TKIs)药物可显著延长NSCLC患者的无疾病进展生存期和总生存期[3-4]。但其疗效与表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突变状态密切相关，因此，EGFR基因突变检测成为EGFR-TKIs药物临床应用的前提和基础[5-6]。肺癌组织或脱落肺癌细胞是检测EGFR基因突变的最理想样本，但由于各种原因，尤其对于大多复发患者，往往无法获取上述样本。基于外周血采样的微创和便利，探讨外周血进行EGFR基因突变检测无疑有助于筛选出更多的肺癌患者接受EGFR-TKIs治疗。

本研究利用扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system，ARMS)联合肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)技术对晚期肺腺癌患者肿瘤组织/恶性胸腔积液和与其匹配的血浆样本行EGFR基因的突变检测，旨在评估血浆样本在临床EGFR基因检测中的应用价值，为指导临床靶向治疗提供参考和依据。

1 资料与方法

1.1 病例与样本

1.1.1 病例一般情况 取得患者及家属知情同意后，收集2016年1月至2016年8月期间蚌埠医学院第一附属医院200例肺腺癌患者的石蜡包埋肿瘤组织/恶性胸腔积液样本和其相对应的新鲜全血样本。患者年龄在42～80岁之间；其中女性患者108例，男性患者92例；根据ICC 2009年新的第7版修订标准进行TNM分期，Ⅲ期患者95例，Ⅳ期患者105例；经组织或细胞病理学确诊，200例患者均为腺癌。

1.1.2 组织样本采集 石蜡包埋组织样本共146例(其中手术切除标本98例，纤维支气管镜活检样本42例，经皮肺穿刺样本6例)，恶性胸腔积液54例，所有样本均经组织或细胞病理学确诊为腺癌。

1.1.3 血浆标本采集 抽取肺腺癌患者全血5 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，3 h内进行血浆初次分离(800 g离心10 min)，将分离得到的血浆1 600 g再次离心10 min，吸取上层血浆，-80℃保存。

1.2 检测方法

1.2.1 石蜡包埋组织DNA的提取 采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司，HGN-tq0850)，参照说明书操作步骤进行石蜡切片或恶性胸腔积液脱落癌细胞的DNA提取。采用Thermo Fisher公司的NanoDrop2000超微量分光光度计对提取后的DNA浓度和纯度进行检测，其中A260/A280要求在1.8～2.0之间。

1.2.2 血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的提取 采用血清/血浆游离DNA提取试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司，HGN-tq1150)，参照说明书操作步骤进行血浆样本中cfDNA的提取。采用Thermo公司的NanoDrop2000超微量分光光度计对提取后的cfDNA浓度和纯度进行检测，其中A260/A280要求在1.7～2.1之间。

1.2.3 ARMS-PNA法检测EGFR突变 分别取40 μL组织/胸腔积液来源(3～5 ng/μL)和血浆来源的DNA(25～35 ng/μL)，按照人类EGFR基因突变检测试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司，HGN-er01)说明书的操作步骤，应用实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480Ⅱ，瑞士)检测样本中EGFR的突变情况。PCR扩增过程包括3个阶段，第1阶段包含1个循环(95℃，5 min)，第2阶段包含15个循环(95℃，20 s；62℃，20 s)，第3阶段包含31个循环(95℃，20 s；60℃，40 s)。检测结果按照海吉力EGFR检测试剂盒说明书的判读标准进行判读。按照双盲实验的设计原则，石蜡包埋组织和血浆样本的实验结果由不同的实验人员独立进行记录，汇总后再进行数据分析。

1.3 统计学分析

数据处理采用SPSS 22.0统计软件，不同样本之间检测结果的差异比较采用卡方检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。利用Kappa系数对2种样本检测结果的一致性进行分析，Kappa≥0.75为两者一致性较好；0.75>Kappa≥0.4为两者一致性一般；Kappa<4为两者一致性较差。

2 结果

2.1 NSCLC患者中EGFR基因突变检测结果

在200例肺腺癌患者的组织/恶性胸腔积液样本中，共检测出EGFR基因突变阳性患者92例(46.00%)，阴性患者108例(54.00%)；血浆样本检测中，EGFR基因突变阳性患者66例(33.00%)，阴性患者134例(67.00%)，两种样本之间的检测结果差异具有统计学意义(P<0.01)。

在本研究中，EGFR的基因突变类型以19和21外显子为主。在组织/恶性胸腔积液样本中，19外显子突变检测到50例(25.00%)，21外显子突变检测到42例(21.00%)；在血浆样本中，19外显子突变检测到42例(21.00%)，21外显子突变检测到24例(12.00%)，两种样本中EGFR基因的突变位点情况也具有显著性差异(P<0.01)。

对不同样本的EGFR基因突变情况和患者的临床信息进行分析后发现，检测结果与患者的年龄、性别和临床分期均没有相关性(P>0.05)，见表1。

表1 患者的临床特征与不同样本中EGFR基因突变
的相关性[例(%)]
Table 1 Correlation of clinical characteristics and EGFR gene mutation in different samples [(n)%]

临床特征组织/恶性胸腔积液阳性样本血浆阳性样本P值年龄≤60岁34(17.00)28(14.00)>60岁58(29.00)38(19.00)0.298性别女性58(29.00)46(23.00)男性34(17.00)20(10.00)0.243临床分期Ⅲ期40(20.00)26(13.00)Ⅳ期52(26.00)40(20.00)0.364

2.2 不同类型样本EGFR检测结果的一致性

在200例肺腺癌患者的EGFR基因检测结果中，组织/恶性胸腔积液和血浆样本检测结果完全符合的样本共有174例，其中阳性结果一致的样本数为66，阴性结果一致的样本数为108。其中有26例患者的组织/恶性胸腔积液样本检测结果为阳性，血浆样本检测为阴性。与组织/恶性胸腔积液样本相比，血浆EGFR基因检测的灵敏度为71.73%，特异度为100.00%，总符合率为87.00%，一致性系数(Kappa)为0.733，2种样本EGFR检测结果之间的一致性处于一般水平(表2)。

表2 不同样本中EGFR基因检测结果的一致性分析
Table 2 Consistency analysis of EGFR gene mutation from different samples

血浆组织/恶性胸腔积液样本+-合计Kappa系数+66066-26108134合计921082000.733

2.3 Ⅲ/Ⅳ期患者不同类型样本EGFR检测结果的一致性

在95例Ⅲ期肺腺癌患者的EGFR基因检测结果中，组织/恶性胸腔积液和血浆样本检测结果一致的样本共有81例，其中阳性结果一致的样本数为26，阴性结果一致的样本数为55。其中有14例患者的组织/恶性胸腔积液样本检测结果为阳性，血浆样本检测为阴性。与组织/恶性胸腔积液样本相比，Ⅲ期肺腺癌患者的血浆EGFR基因检测的灵敏度为65.00%，特异度为100.00%，总符合率为85.26%，一致性系数(Kappa)为0.683，2种样本EGFR检测结果之间的一致性处于一般水平(表3)。

表3 Ⅲ期NSCLC患者不同样本中EGFR基因
检测结果的一致性分析
Table 3 Consistency analysis of EGFR gene mutation from different samples of stage Ⅲ NSCLC patients

血浆组织/恶性胸腔积液样本+-合计Kappa系数+26026-145569合计4055950.683

在105例Ⅳ期肺腺癌患者的EGFR基因检测结果中，组织/恶性胸腔积液和血浆样本检测结果一致的样本共有93例，其中阳性结果一致的样本数为40，阴性结果一致的样本数为53。其中有12例患者的组织/恶性胸腔积液样本检测结果为阳性，血浆样本检测为阴性。与组织/恶性胸腔积液样本相比，Ⅳ期NSCLC患者血浆EGFR基因检测的灵敏度为76.92%，特异度为100.00%，总符合率为88.57%，一致性系数(Kappa)为0.771，2种样本EGFR检测结果之间的一致性处于较好水平(表4)。

表4 Ⅳ期NSCLC患者不同样本中EGFR基因
检测结果的一致性分析
Table 4 Consistency analysis of EGFR gene mutation from different samples of stage Ⅳ NSCLC patients

血浆组织/恶性胸腔积液样本+-合计Kappa系数+40040-125365合计52531050.771

3 讨论

2015年国家癌症中心数据显示，我国肺癌患病率是130.2/10万。其中男性84.6/10万，居恶性肿瘤第2位，女性45.6/10万，居恶性肿瘤第4位[7]，其中，85%左右的肺癌患者属于NSCLC。由于既往缺乏有效的治疗手段，肺癌的死亡率居高不下。以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗为肺癌治疗带来了新的希望，同时也拉开了肺癌精准治疗的序幕。基于EGFR-TKIs药物疗效与EGFR基因突变状态密切相关，EGFR基因突变检测成为行肺癌EGFR-TKIs靶向治疗的关键环节。

目前临床上进行EGFR基因突变检测的样本主要有手术切除的肿瘤组织、穿刺样本及恶性胸腔积液等。部分患者在首诊时已经错过手术治疗的最佳时期，或因患者年龄、身体状况等因素而放弃手术治疗，无法获得手术切除的肿瘤标本。临床上亦可通过支气管镜活检、CT定位下肺穿刺、胸腔镜下活检等手段获取穿刺标本，但该方式获取的肿瘤组织量有限，所含遗传学信息不全，导致检测结果不准确，同时还存在由于穿刺导致的各种并发症[8-9]。恶性胸腔积液是肿瘤晚期常见的并发症之一，但并非所有的晚期肿瘤患者都会出现恶性胸腔积液[10]。因而，临床上迫切需要一种微创、取样方便、不受患者身体状况和临床分期影响的标本类型来实现EGFR基因检测。

外周血中存在许多DNA片段，被称之为游离DNA(cfDNA)，主要来源于人体细胞的凋亡、坏死和分泌。除正常细胞外，肿瘤细胞也可以从病灶上脱落进入外周血或凋亡后DNA释放进入外周血循环中，这部分DNA称之为循环肿瘤DNA(cell free circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA在cfDNA的总量中只占很小一部分[11-12]。研究表明，肿瘤组织来源的ctDNA中的基因突变状况与肿瘤细胞中DNA保持一致，且肿瘤患者外周血游离DNA含量比正常健康人增高10倍[13-14]，因此利用外周血中的ctDNA检测癌症患者的相关基因突变是切实可行的，还可以实现肿瘤基因的动态监测和TKIs耐药随检。

本研究中，采用ARMS-PNA技术分别检测组织/恶性胸腔积液和匹配血浆中EGFR基因突变状态，结果发现，组织/恶性胸腔积液的EGFR突变率明显高于血浆，存在显著性差异，提示在临床应用中，血浆EGFR基因突变检测并不能完全取代组织/恶性胸腔积液。进一步分析发现，EGFR基因突变状态与患者的年龄、性别、临床分期等均无显著相关性。

影响ctDNA检测灵敏度的因素主要有肿瘤患者的临床分期、血浆样本的处理方法、ctDNA的提取质量、检测方法的灵敏度等因素[15]。在既往的IPASS、IGNITE和IFUM等3项研究[16-18]中，通过血浆ctDNA检测EGFR基因突变具有较高的特异度(100.0%、97.2%和99.8%)，但灵敏度相对较低(43.1%、49.6%和65.7%)。在本研究中，比较组织/恶性胸腔积液和血浆样本的EGFR检测结果，血浆样本检测EGFR基因突变的特异度高达100.00%，灵敏度为71.73%，其中Ⅲ期患者样本的检测灵敏度为65.00%，Ⅳ期患者的检测灵敏度提高到76.92%。由于不同分期的肿瘤患者血液中ctDNA的含量有所不同，晚期患者血液中ctDNA的含量远高于早、中期患者，呈正相关性[19]。本研究中，Ⅳ期患者血浆的EGFR基因检测灵敏度明显高于Ⅲ期患者，说明随着癌症的进展，血浆样本在晚期肺腺癌患者中的应用优势更加明显。

目前，ARMS技术已经是临床上认可度较高的基因检测方法[10-21]，检测灵敏度可以达到1%的水平。ARMS-PNA是一种EGFR基因突变检测专利技术。PNA是具有类多肽骨架的DNA类似物，可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体，通过PNA技术可以有效抑制野生型模板的扩增。ARMS技术针对引物3′端进行等位基因特异性的区分，利用ARMS引物3′端的高度特异性来识别突变位点，提高检测灵敏度，可以检测到10 ng基因组背景下1%～1‰的基因突变情况。本研究表明，ARMS-PNA技术在血浆ctDNA检测EGFR基因上的应用具有一定优势。

综上所述，本研究结果提示，与晚期肺腺癌组织/恶性胸腔积液相比，血浆EGFR突变检测具有高度的特异性，但灵敏度相对较低。当肿瘤组织/恶性胸腔积液难以获取时，血浆可以作为EGFR基因突变检测的合适样本，从而可更大程度地让更多的肺癌患者有机会接受EGFR-TKIs治疗。

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(2016-09-01 收稿)

Detection of EGFR Gene Mutations in Plasma from Advanced Lung Adenocarcinoma Patients by ARMS-PNA Method

Min Shengping,Liu An,Hong Leietal

AnhuiClinicalandPreclinicalKeyLaboratoryofRespiratoryDisease;DepartmentofRespiratoryandCriticalMedicine,FirstAffiliatedHospital,BengbuMedicalCollege,Bengbu233000

Objective To detect epithelial growth factor receptor (EGFR) gene mutations in tissue/malignant pleural effusion and its matched plasma from advanced lung adenocarcinoma patients,and then to evaluate the application value of detection of EGFR mutations in plasma.Methods Tissue/malignant pleural effusion and its matched plasma were collected from 200 lung adenocarcinoma patients at stage Ⅲ/Ⅳ,and the mutations of EGFR gene were detected by using amplification refractory mutation system-peptide nucleic acids (ARMS-PNA) method.Results The positive rate of EGFR mutations in tissue/malignant pleural effusion was 46.00%,significantly higher than that in plasma (33.00%).Compared with tissue/malignant pleural effusion,the sensitivity of detection of EGFR mutations in plasma was 71.73%,the specificity was 100.00%,and the total corresponding rate was 87.00%.Notably,the sensitivity of detection of EGFR mutations in plasma from lung carcinoma patients at stage Ⅳ (76.92%) was higher than that at stage Ⅲ (65.00%).Conclusion Compared with tissue/malignant pleural effusion from advanced lung adenocarcinoma,plasma sample used for detection of EGFR mutations has high specificity,but low sensitivity.If it is hard to get tissue/malignant pleural effusion,plasma could serve as an adaptable sample for detection of EGFR mutations in advanced lung adenocarcinoma.

epithelial growth factor receptor; lung adenocarcinoma; plasma; ARMS-PNA method

*安徽省科技攻关计划资助项目(No.12010402127)；高校优秀青年人才支持计划重点项目(No.gxyqZD2016168)；安徽省科技计划项目(重点实验室类)(No.1506c085014)

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.014

闵生萍，女，1980生，医学学士，技师，E-mail：minshengping@126.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：wangxiaojing8888@163.com