FGFR4基因rs351855单核苷酸多态性与中国汉族人群前列腺癌术后生化复发的关联性*

陈路遥， 马 鑫， 雷振伟， 黄庆波， 张 勇， 林 峰， 郝 鹏， 杨明刚， 赵雪涛， 陈 军， 刘功学， 郑 涛△

1中国人民解放军总医院泌尿外科，北京 1008532武汉市普爱医院泌尿外科，武汉 430033



FGFR4基因rs351855单核苷酸多态性与中国汉族人群前列腺癌术后生化复发的关联性*

陈路遥1， 马 鑫1， 雷振伟1， 黄庆波1， 张 勇2， 林 峰2， 郝 鹏2，
杨明刚2， 赵雪涛2， 陈 军2， 刘功学2， 郑 涛2△

1中国人民解放军总医院泌尿外科，北京 100853
2武汉市普爱医院泌尿外科，武汉 430033

目的 探讨FGFR4基因rs351855单核苷酸多态性与中国汉族人群前列腺癌术后生化复发的相关性。方法提取346例前列腺癌患者外周血DNA，采用Sequenom MassARRAY法检测rs351855位点基因型；收集患者临床信息并随访，分析比较生化复发组与未生化复发组之间数据；采用Kaplan-Meier生存曲线和COX回归分析基因型对术后无生化复发生存的影响。结果 346例患者中有124例(35.8%)发生术后生化复发。两组间术前前列腺特异抗原(PSA)水平、Gleason评分、TNM分期、切缘情况及rs351855基因型分布具有显著差异。生存分析显示不同基因型之间无生化复发生存差异具有统计学意义，携带AA/AG基因型个体较GG基因型具有更差的预后；多因素分析显示rs351855基因型是独立的预测术后无生化复发生存的因子(HR=1.873，95%CI：1.209～2.901，P=0.005)。结论 FGFR4基因rs351855多态性位点与中国汉族人群前列腺癌术后生化复发有联系，可以作为预测术后生化复发的分子标记物，指导临床评估和随访。

前列腺癌基因； FGFR4基因； 基因多态性； 生化复发

前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，随着人口老龄化和早期筛查的普及，其发病率逐年增加，资料显示仅在美国每年就有约23万例新诊断的前列腺癌患者以及3万例的疾病相关致死数[1]。目前对于被诊断为临床局限的肿瘤，根治性前列腺切除术仍是首选治疗方法，然而术后约有30%的患者会出现生化复发，预后不佳[2]。传统的临床病理预后因子包括术前前列腺特异性抗原(PSA)水平、Gleason评分、病理分级等，它们被用于评估术后复发的风险。近年来大量研究致力于寻找新的分子标志物以评估术后疾病复发的危险性，从而指导临床随访和治疗。全基因组关联研究发现，部分遗传突变位点与前列腺癌发病风险及预后相关联，然而大多数研究对象是欧美人群[3-5]，针对亚洲尤其是中国汉族人群的研究尚少，需要进一步深入研究验证。

FGFR4是成纤维细胞生长因子受体家族成员之一，参与到细胞分化、发育、激素信号通路和增殖通路等生理过程[6]；此外，其介导的信号通路在肿瘤生长和进展中也发挥重要的作用[7]。近年来FGFR4基因的多态性位点被发现与许多肿瘤包括肺癌、胃肠道肿瘤和卵巢癌等发病风险和预后相关[8-10]。最近的1篇系统评价显示其rs351855位点(Gly388Arg)与前列腺癌发病风险相关，与Gly388相比，Arg388增加了17%的风险[11]。此外FitzGerald等[12]回顾性分析1 458例美国前列腺癌患者，发现该位点与肿瘤特异性致死率相关；日本学者研究也显示rs351855影响了前列腺癌的进展[13]。目前尚未见该位点与中国汉族人群前列腺癌的相关报道，rs351855是否与中国汉族人群前列腺癌预后相关尚需要进一步验证。本研究回顾性分析346例前列腺癌患者资料，并检测其FGFR4基因rs351855多态性位点，探讨其与中国汉族人群前列腺癌术后预后的相关性及其是否能够作为潜在的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本组346例患者外周静脉血来自解放军总医院泌尿外科2010年1月至2013年12月住院的前列腺癌患者，均为汉族男性，术前诊断为临床局限性肿瘤，行腹腔镜或机器人前列腺根治性切除术，术后病理组织学证实为前列腺腺癌。肿瘤分期采用2010年TNM分期标准，并根据WHO标准进行组织学Gleason评分。患者外周血标本采集后保存在-80℃冰箱中。本研究通过了解放军总医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 基因多态性分型

采用Qiagen Blood Mini血液基因组提取试剂盒，按试剂说明书抽提外周血的基因DNA，并经NanoDrop 1000分光光度计测定其纯度和浓度，质控吸光度A260/A280比值在1.8～2.0后保存于-20℃冰箱中。

FGFR4 rs351855多态性位点分型采用Sequenom MassARRAY进行检测。经过多重PCR扩增，将产物经碱性磷酸化处理，然后进行单碱基延伸反应，树脂纯化后进行芯片点样和质谱检测。针对rs351855位点设计的引物由北京金唯智生物公司合成，所用的引物序列分别如下：1st Primer：5′-AAGCGGGAGAGCTTCTGCAC-3′；2nd primer：5′-CTTGGCTGTGCTCCTGCTG-3′；Extend primer：5′-TCCCGCCCTCGATACAGCC-3′。同时随机挑选5%的样品进行DNA测序验证可靠性。

1.3 收集资料与随访

收集患者的术前临床数据(年龄、BMI、术前PSA水平、术前影像学检查资料等)和术后病理相关数据(Gleason评分、病理分期、手术切缘情况等)。术后常规进行门诊或电话随访患者情况。患者术后常规每3个月进行血PSA检测。根据CUA2014指南，生化复发定义为根治术后间隔3个月的连续2次血PSA水平监测大于0.2 ng/mL；对于未出现复发患者，以最后一次随访时间作为截点进行统计分析。

1.4 统计方法

连续变量结果以均数±标准差表示。根据连续或分类资料分别采用t检验或卡方检验分析两组间差异。基因型对生化复发时间的影响采用Kaplan-Meier生存曲线进行检测；同时将临床病理数据与rs351855基因多态性纳入单因素COX回归风险分析模型，进而将P<0.1的项目纳入多因素模型检测其独立性，以HR和95%CI表示其风险。所有统计分析采用SPSS 19.0软件，以双侧P<0.05为差异具有统计意义。

2 结果

2.1 一般资料

本组346例前列腺癌患者平均年龄(65.9±7.0)岁，均得到完全随访，中位随访时间为37.8个月。截止到最后一次随访时，共有124名患者出现前列腺癌复发，占总病例的35.8%。根据是否生化复发将346例患者分为两组：生化复发组和未生化复发组。表1为两组临床病理资料对比，可见两组在年龄与BMI方面无统计学差异(均P>0.05)；复发组较未复发组术前PSA水平更高(P<0.001)，Gleason评分≥8比例更高(38.7%vs.22.5%，P=0.001)；此外复发组的病理分期和切缘阳性率显著高于未复发组(P=0.004和0.045)。

2.2 基因型分布

346例前列腺癌患者rs351855多态性位点均被成功分型，随机送检5%的样品测序显示准确性为100%，基因型分布为112例GG、186例AG和48例AA。在生化复发组中基因型分布为30例GG、68例AG和26例AA，而在未复发组中分布为82例GG、118例AG和22例AA；两组间基因型分布差异具有统计学意义(P=0.004，表1)。

表1 前列腺癌术后生化复发组与无生化复发组临床病理参数比较
Table 1 Clinicopathological characteristics of prostate cancer patients in biochemical recurrence group and biochemical recurrence-free group after radical prostatectomy

变量总体生化复发组无生化复发组P值病例数346124222年龄(岁,x±s)65.9±7.065.3±7.266.2±6.90.253BMI[例(%)]0.277 <24kg/m2136(39.3)43(34.7)93(41.9) ≥24kg/m2210(60.7)81(65.3)129(58.1)术前PSA[例(%)]<0.001 ≤20ng/mL211(61.0)56(45.2)155(69.8) >20ng/mL135(39.0)68(54.8)67(30.2)Gleason评分[例(%)]0.001 ≤7分248(71.7)76(61.3)172(77.5) ≥8分98(28.3)48(38.7)50(22.5)TNM分期[例(%)]0.004 T1/2N0M0250(72.3)78(62.9)172(77.5) T3/4N1M096(27.7)46(37.1)50(22.5)切缘情况[例(%)]0.045 阳性132(38.2)56(45.2)76(34.2) 阴性214(61.8)68(54.8)146(65.8)rs351855基因型[例(%)]0.004 GG112(32.4)30(24.2)82(36.9) AG186(53.7)68(54.8)118(53.2) AA48(13.9)26(21.0)22(9.9)

BMI：体质指数；PSA：前列腺特异性抗原；TNM分期T1/2N0M0：局限性，T3/4N1M0：局部进展

2.3 生存分析

将rs351855位点的基因型与术后生化复发时间相关联，采用Kaplan-Meier生存曲线分析，发现3种基因型在前列腺癌无复发生存上有显著差异(P=0.001，图1A)，GG基因型携带者有相对较好的无复发生存，而AA基因型携带者有相对较差的无复发生存。进一步根据遗传模型分为隐性模型(AA/AGvs.GG)和显性模型(GG/AGvs.AA)进行分析，结果显示在两种模型下无复发生存同样具有显著性差异(P=0.002和0.004，图1B和1C)。

A：3种基因型；B：隐性模型；C：显性模型图1 FGFR4基因rs351855不同基因型无生化复发生存曲线比较Fig.1 Kaplan-Meier survival analysis for BCR-free survival after radical prostatectomy according to FGFR4 rs351855 genotypes

将临床病理资料转为分类变量后，纳入COX风险模型分析(表2)，单因素分析显示年龄与BMI对前列腺癌术后无生化复发生存无明显影响，术前PSA(P<0.001)、Gleason评分(P=0.001)和TNM分期(P=0.005)对无生化复发生存有显著性影响，切缘阳性情况仅有临界性统计学意义(P=0.067)。对于rs351855位点，AA/AG与GG对比有明显较差的生存情况(HR=1.883，95%CI：1.244～2.850，P=0.003)。进一步进行多因素分析，将单因素分析P<0.1变量纳入模型，结果显示术前PSA、Gleason评分、TNM分期和rs351855基因型与无生化复发生存仍具有统计学相关性，其中AA/AG与GG相比具有明显较差的预后(HR=1.873，95%CI：1.209～2.901，P=0.005)，显示rs351855基因型与其他3项变量均是独立的预测前列腺癌术后无生化复发生存的影响因子。

表2 FGFR4 rs351855基因多态性与前列腺癌术后无生化复发生存的危险相关性分析
Table 2 Cox proportional hazards analysis of rs351855 gene polymorphism in FGFR4 associated with PSA recurrence after radical prostatectomy

变量单因素COX分析HR(95%CI)P值多因素COX分析HR(95%CI)P值年龄 ≤65岁1.00 >65岁0.974(0.921～1.124)0.863BMI <24kg/m21.00 ≥24kg/m21.160(0.803～1.676)0.430术前PSA ≤20ng/mL1.001.00 >20ng/mL2.340(1.642～3.335)<0.0011.938(1.331～2.822)0.001Gleason评分 ≤7分1.001.00 ≥8分1.858(1.291～2.673)0.0011.609(1.107～2.339)0.013TNM分期 T1/2N0M01.001.00 T3/4N1M01.680(1.166～2.420)0.0051.757(1.182～2.612)0.005切缘情况 阴性1.001.00 阳性1.394(0.977～1.989)0.0671.181(0.786～1.773)0.423rs351855 GG1.001.00 AA/AG1.883(1.244～2.850)0.0031.873(1.209～2.901)0.005

3 讨论

基因多态性与疾病相关性的研究近些年成为热点，肿瘤等多基因疾病临床表型多样化，阐明基因型与表型直接的联系对于发现肿瘤的发病机制和预测其预后有着重要作用[14-15]。前列腺癌的发病机制目前尚不清楚，近年来有许多研究关注基因多态性与前列腺癌发病风险和预后的相关性，其中FGFR4基因rs351855位点是热点之一。尽管在欧美人群中已经被证明与发病风险和疾病特异性死亡率有关联，在亚洲人群尤其是中国汉族人群尚未见报道。前列腺癌的发病具有显著的种族差异，有着明显的遗传异质性，因此该位点单核苷酸多态性与中国汉族人群前列腺癌是否有相关性是本文的研究目标。

本研究收集解放军总医院泌尿外科346例前列腺癌患者信息，分析其FGFR4基因rs351855基因型与术后无生化复发生存的相关性，结果显示该位点不同基因型与生化复发相关，其中AA/AG携带者与GG携带者相比，无生化复发生存情况较差，同时多因素COX回归也显示rs351855是独立的预后危险因子。

关于FGFR4基因多态性与前列腺癌的潜在分子机制已经有学者提出了几种可能性。Wang等[16]建立2株分别表达FGFR4 Arg388和Gly388的前列腺上皮细胞系，通过功能实验检测发现表达Arg388的细胞系其细胞迁移和侵袭能力较Gly388明显增强，进一步机制研究显示Arg388能够上调尿激酶型纤溶酶原激活物受体表达，后者是尿激酶纤溶酶激活系统关键因子，且已经被证明参与多种肿瘤的侵袭和转移过程。另一项研究通过对2种细胞系进行基因表达芯片的检测，发现Arg388可以激活ERK信号通路从而与前列腺癌恶性潜能相关联[17]。最近Ulaganathan等[18]发现由Gly388突变为Arg388会改变跨膜段从而暴露出近膜质的STAT3，继而募集STAT3蛋白至内层细胞膜，加强STAT3的酪氨酸磷酸化。以上这些基础研究能够解释我们的发现，即携带A等位基因的患者有更差的预后。

本次研究首次评估FGFR4基因单核苷酸多态性对中国汉族人群前列腺癌患者术后无生化复发生存的影响，并发现rs351855位点可以应用于临床检测其复发危险性。但是仍有一些不足之处，首先我们的研究是回顾性分析，与欧美类似研究相比样本量偏小，可能出现一定的偏移；其次我们选取的研究终点是生化复发时间，而非疾病特异性死亡时间，这与我们随访时间相对较短有关；最后FGFR4基因的其他多态性位点有可能也会影响结果，但未在本研究中检测，因此还需要更大样本更多位点检测来验证我们的初步发现。

综上所述，本次研究初步发现FGFR4基因rs351855多态性位点不同基因型对中国汉族人群前列腺癌术后生化复发有影响；rs351855位点可以作为独立的无生化复发生存预后因子指导临床评估和随访。

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(2016-09-26 收稿)

Association between rs351855 Single Nucleotide Polymorphism of FGFR4 Gene and Biochemical Recurrence after Radical Prostatectomy in a Chinese Population

Chen Luyao，Ma Xin，Lei Zhengweietal

DepartmentofUrology，ChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，China

Objective To evaluate the association between rs351855 single nucleotide polymorphism of FGFR4 gene and the biochemical recurrence(BCR)of prostate cancer in Chinese men after radical prostatectomy.Methods Peripheral blood DNA was extracted from 346 prostate cancer patients and the polymorphism rs351855 was genotyped by using Sequenom Mass ARRAY system.Clinical data and follow-up information were collected and compared between recurrence group and non-recurrence group.Kaplan-Meier curves and Cox proportional hazard models were used for survival analysis.Results During the follow-up period，124(35.8%)patients experienced PSA recurrence.Patients with recurrence possessed higher PSA levels at diagnosis，higher Gleason score，and higher proportions of advanced stage and positive surgical margin than the patients without recurrence.Survival analysis showed that BCR free survival was significantly affected by the genotypes of rs351855.After adjusting for other variables in multivariable analysis，patients with rs351855 AA/AG genotypes showed significantly worse BCR-free survival than those with the GG genotype(HR=1.873，95%CI：1.209-2.901，P=0.005).Conclusion FGFR4 rs351855 could be a novel independent prognostic factor of BCR after radical prostatectomy in the Chinese population.This functional polymorphism may also provide a basis for clinical evaluation and surveillance programs.

prostate cancer； FGFR4 gene； polymorphism； biochemical recurrence

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2015CFB289)；武汉市科技计划资助项目(No.2013072304010833)

R737.25

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.003

陈路遥，男，1991年生，医学博士，E-mail：chenluyao301@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：tonyzt9007@163.com