4种天然药物对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用的比较*

张淑琴， 胡赤丁， 陈 茜， 肖天雄， 杨广笑， 何光源， 陈明洁△

江汉大学附属医院 1神经内科 2肿瘤科，武汉 4300153华中科技大学同济医学院附属同济医院医院感染管理科，武汉 4300304华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074



4种天然药物对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用的比较*

张淑琴1， 胡赤丁2， 陈 茜3， 肖天雄4， 杨广笑4， 何光源4， 陈明洁4△

江汉大学附属医院1神经内科2肿瘤科，武汉 430015
3华中科技大学同济医学院附属同济医院医院感染管理科，武汉 4300304华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074

目的 比较吉马酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯等4种天然药物对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制效果，并探讨其作用机制。方法 通过MTT法比较4种药物对HepG2细胞增殖的影响，流式细胞仪分析其对细胞凋亡的影响。Western blot法检测药物处理前后细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达变化。结果 4种药物均呈浓度依赖性地抑制HepG2细胞的增殖，其中淫羊藿素对HepG2的抑制效果最为明显，作用48 h半抑制浓度IC50为30 μmol/L；4种药物均诱导HepG2细胞凋亡，淫羊藿素诱导细胞凋亡的效果最显著，30 μmol/L淫羊藿素处理48 h后，细胞凋亡率达到51.1%；4种药物均不同程度抑制周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、CDK1、CDK2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高促凋亡蛋白Bax的表达。结论 4种天然药物在体外能明显抑制人肝癌细胞HepG2的增殖，诱导其凋亡，淫羊藿素效果最为显著；其分子机制与调节抑制细胞增殖和促凋亡相关蛋白的表达有关。

吉马酮； 芝麻素； 淫羊藿素； 褐藻多糖硫酸酯； 人肝癌细胞HepG2； 增殖； 凋亡

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差，成为我国第2位的肿瘤死亡原因，严重危害人群的健康[1-2]。目前临床常用抗肿瘤化疗药物、放射性疗法对人体的副作用很大，治疗过程中严重损害机体的自身免疫力，因此，亟待开发毒性低、药效高的新型抗肿瘤药物。天然药物是开发抗肿瘤药物的重要资源，多种天然药物已被用于肝癌治疗的研究[3-4]，其中莪术油中的吉马酮、芝麻籽中的芝麻素、淫羊藿中的淫羊藿素和海藻提取物褐藻多糖硫酸酯均呈现较为明显的抑制肝癌细胞增殖的效果[5-8]。本研究通过比较4种天然药物吉马酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯处理人肝癌细胞HepG2的结果，探讨4种天然药物发挥作用的分子机制，比较其各自的优势，为抗肿瘤药物的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

芝麻素和淫羊藿素购自上海融禾医药有限公司，吉马酮购自四川成都曼斯特生物有限公司，褐藻多糖硫酸酯、胰蛋白酶(Typsin)、MTT以及DMSO均购自Sigma公司。无支原体胎牛血清购自杭州四季青公司，青霉素-链霉素溶液购自安特捷生物技术有限公司。AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，GAPDH、CDK2、Cyclin A、Cyclin B1、CDK1、Bax、Bcl-2等多克隆抗体购于Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购于武汉博士德生物工程公司。

1.2 细胞培养

人肝癌细胞株HepG2购自中国典型培养物保藏中心(CTCC)，细胞培养采用含10%无支原体胎牛血清和1%双抗(青霉素-链霉素溶液)的DMEM高糖培养液，于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.3 细胞增殖测定

采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至96孔板2×104个/孔，待细胞贴壁后，更换分别含有不同浓度药物的新鲜培养液，继续培养24 h或48 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后弃上清，每孔加入100 μL DMSO，37℃暗培养15 min后，于490 nm测定吸光度值，以完全培养液为空白对照。细胞增殖率=处理组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.4 细胞周期分析

采用PI染色法和流式细胞术分析细胞周期。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至96孔板，2×105个/孔，细胞贴壁后，更换含有各种药物的新鲜培养液，以完全培养液为空白对照。处理48 h后，收集细胞并用PBS洗涤2次，去上清，每个样品加入500 μL缓冲液重悬细胞，加入100 μL PI，混匀后室温避光孵育30 min。通过流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟合软件ModFit分析。

1.5 细胞凋亡检测

采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法和流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至6孔板，2×105个/孔，细胞贴壁后，更换含有一定浓度药物的新鲜培养液处理一定时间后，收集细胞、PBS洗涤、500 μL缓冲液重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，混匀后室温避光孵育15 min，于l h内用流式细胞仪检测。

1.6 蛋白表达分析

采用Western blot法检测与细胞生长和凋亡相关的蛋白表达。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至6孔板，1×105个/孔，药物处理48 h后，收集细胞、裂解细胞、提取蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，据此计算蛋白电泳上样量。每孔上样30 μg蛋白进行10% SDS-PAGE分离，电泳结束后通过电转移转至硝酸纤维素膜上，4℃封闭过夜，洗膜后分别以1∶200和1∶500比例加入特定抗体进行一抗孵育，随后以二抗于室温孵育2 h，TBST洗膜后，显影定影。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 10.0统计分析软件，计量资料组间均数比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 4种药物对HepG2细胞增殖的影响

MTT法检测结果表明，4种药物梯度浓度处理HepG2细胞24 h和48 h后，与对照组相比，细胞增殖率均下降(P<0.05，P<0.01)，如图1所示，在实验浓度范围内，4种药物对细胞增殖的抑制作用均呈现浓度依赖性。处理48 h半抑制浓度IC50分别为吉马酮120 μmol/L、芝麻素98 μmol/L、淫羊藿素30 μmol/L、褐藻多糖硫酸酯4 g/L，其中淫羊藿素对细胞增殖的抑制效果最为显著。

2.2 4种药物对HepG2细胞周期的影响

PI染色法和流式细胞术分析结果如表1所示，与相应的空白对照相比，吉马酮、芝麻素和褐藻多糖硫酸酯均显著提高G2/M期细胞比例(均P<0.05)，表明此3种药物诱导肝癌细胞G2/M期阻滞；淫羊藿素显著提高S期细胞比例(P<0.05)，表明此药物可诱导肝癌细胞S期阻滞。

2.3 4种药物对HepG2细胞凋亡的影响

细胞凋亡检测结果表明，4种药物处理48 h后，HepG2细胞均出现明显凋亡现象，其中淫羊藿素诱导细胞凋亡效果最为显著，30 μmol/L淫羊藿素处理后，细胞凋亡率达到51.1%，100 μmol/L芝麻素和4 g/L褐藻多糖硫酸酯处理后细胞凋亡率分别为41.8%和43.7%，呈现出显著的诱导细胞凋亡作用。吉马酮具有一定诱导细胞凋亡作用，120 μmol/L吉马酮处理后细胞凋亡率为14.9%。

表1 4种药物对HepG2细胞周期的影响
Table 1 Effect of four drugs on HepG2 cell cycle

药物处理细胞周期(%)G0/G1SG2/M吉马酮空白对照53.631.914.5120μmol/L吉马酮33.533.832.7*芝麻素空白对照63.731.64.7100μmol/L芝麻素45.231.123.7*淫羊藿素空白对照50.932.716.430μmol/L淫羊藿素38.143.5*18.4褐藻多糖硫酸酯空白对照68.820.310.94g/L褐藻多糖硫酸酯43.733.822.5*

与相应空白对照组比较，*P<0.05

2.4 蛋白表达分析

细胞周期分析结果表明吉马酮、芝麻素和褐藻多糖硫酸酯诱导肝癌细胞G2/M期阻滞，淫羊藿素诱导肝癌细胞S期阻滞，据此结果，我们采用Western blot分析与G2/M和S期阻滞相关的细胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B1、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1和CDK2、促凋亡蛋白Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。结果表明，4种药物处理48 h后，均呈现促凋亡蛋白Bax表达上调和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调；吉马酮和褐藻多糖硫酸酯处理后细胞周期蛋白Cyclin B1和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1的表达呈现下调，Cyclin A和CDK2的表达没有明显变化；淫羊藿素处理后Cyclin A和CDK2呈现表达下调，Cyclin B1和CDK1的表达没有明显变化；芝麻素处理后呈现Cyclin A、Cyclin B1和CDK2的表达下调，CDK1表达没有明显变化；而且相关蛋白的表达水平变化随着药物浓度的增加而加强，具体结果如图2所示。

3 讨论

肝癌是全世界最常见的癌症之一，中国是肝癌的重灾区，中国肝癌人数及死亡率均居世界之首。肝癌目前主要的治疗手段包括手术、化疗和放疗等，然而由于现有的治疗措施对人体的副作用很大，治疗过程中严重损害机体的自身免疫力，而且肝癌扩散速度快、术后高复发率及肝癌细胞对于传统抗癌药物的耐药性，使得开发高效低毒的抗癌新药迫在眉睫。

天然产物是指动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分，如生物碱、黄酮、萜类、糖类、木脂素等，其中包括大量具有生理活性的物质。从天然产物中开发预防和治疗癌症的活性成分已成为研究热点，近年来已经发现多种有抗癌药物潜力的天然产物，如紫杉醇、β-榄香烯等已经应用于癌症的临床治疗[4，9]。

与对照组比较，*P<0.05 **P<0.01图1 HepG2细胞分别经4种药物处理24 h和48 h后细胞增殖率的变化Fig.1 Cell growth rate variation of HepG2 after treatment of four drugs for 24 h and 48 h

图2 4种药物对HepG2细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响Fig.2 Effect of four drugs on expression of proliferation- and apoptosis-related proteins in HepG2

吉马酮是中药莪术的挥发油中的一种，莪术有抗肿瘤、抗血栓等作用[10-11]，研究发现莪术油中的5种挥发油对多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用，其中吉马酮对人肝癌细胞HepG2具有较强的抑制作用[5]。淫羊藿素是淫羊藿活性成分之一，是淫羊藿苷在体内的一种代谢产物，在一定浓度内具有雌激素样作用[12]。在传统医学中，淫羊藿是一种补阳、强心、坚骨的药物，现代医学则发现，淫羊藿素对多种肿瘤具有抗肿瘤的作用。研究发现淫羊藿素通过下调促血管生成因子、上调抑制血管生成因子，拮抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤生长[6]；通过PI3K/AKT信号通路激活、抑制非小细胞肺癌H460细胞增殖,达到抗肿瘤作用[13]。所以，淫羊藿素广泛用于乳腺癌、肺癌、肝癌的治疗研究中。芝麻素主要是存在于芝麻籽中的全天然木脂类化合物，具有抗氧化、抗菌、减低胆固醇调节血脂、护肝、抑制肿瘤等多种功效，研究认为低浓度芝麻素的饮食可以抑制肝癌的形成[14]，本研究发现100 μmol/L的芝麻素48 h可诱导细胞凋亡率达41.8%，与以往的研究结果相吻合。而且芝麻素与现代化疗药物CTX或5-FU联合应用于肿瘤的治疗，具有明显的协同增效和减毒作用[7]。褐藻多糖硫酸酯是海洋褐藻的主要生物活性物质，早期的研究侧重点主要在其抗氧化作用方面，近期对于其抗肿瘤作用机制的研究有了一定的发现，研究认为低浓度的褐藻多糖硫酸酯对肝癌细胞体外生长抑制不明显，而浓度高于0.1 mg/mL时对细胞因子的分泌有促进趋势，可提高细胞与分子免疫应答水平，调节细胞因子分泌，发挥抗肿瘤作用[15]。本研究则发现褐藻多糖硫酸酯0.2 g/L开始出现抑制作用，4 g/L时细胞凋亡率可达到43.7%，当然还可能与细胞中还原型GSH耗竭，ROS过度积累致线粒体损伤，从而启动内源性凋亡途径有关[8]。

以前对于以上天然药物的研究都是单一性的，本研究希望同时比较这4种药物在同一条件下的抗肿瘤效应。HepG2细胞作为最经典的肝癌细胞系之一，广泛用于抗肝癌药物的研究。我们通过比较吉马酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯对HepG2细胞的影响来集中探讨并比较这4种天然药物的各自抗肿瘤作用机制。

本研究以HepG2细胞为研究对象，从细胞和分子水平研究了吉马酮、芝麻素、淫羊藿素、褐藻多糖硫酸酯等4种天然药物对HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响以及调控机制。结果表明4种药物对人肝癌细胞HepG2均表现出明显的增殖抑制作用，特别是淫羊藿素效果显著，48 h半抑制浓度仅为30 μmol/L。

进一步探索其作用机制，发现吉马酮和褐藻多糖硫酸酯通过下调G2/M检查点相关的周期蛋白Cyclin B1及其激酶CDK1的表达来诱导G2/M期周期阻滞；芝麻素下调G2/M检查点相关的周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1及其激酶CDK2的表达来诱导G2/M期周期阻滞；淫羊藿素则通过下调S期检查点相关的周期蛋白Cyclin A及其激酶CDK2的表达来诱导S期周期阻滞。4种药物均通过下调细胞周期相关蛋白的表达，使HepG2细胞不能通过检查点，无法进入分裂期，从而抑制其增殖。

诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤的一个重要手段。研究发现，芝麻素、淫羊藿素和褐藻多糖硫酸酯均显著促进HepG2细胞凋亡，吉马酮亦具有一定的诱导HepG2细胞凋亡的作用。4种药物均提高促凋亡蛋白Bax的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

通过比较发现，淫羊藿素对HepG2细胞的作用效果最为显著，其他3种药物亦表现出较为明显的抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的作用。本研究从细胞和分子水平初步探讨4种药物抑制HepG2细胞的关键作用靶标，探索其发挥药物作用的物质基础和作用机制，为开发新的安全有效的抗肿瘤药物提供了一定的细胞学和分子生物学依据。

[1] Forner A，Hessheimer A，Real M，et al.Treatment of hepatocellular carcinoma[J].Crit Rev Oncol Hematol，2006，60(2)：89-98.

[2] Chen J G，Zhang S W.Liver cancer epidemic in China：past，present and future[J].Semin Cancer Biol，2011，21(1)：60-66.

[3] 吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用，地位和存在的问题[J].中西医结合学报，2003，1(3)：163-164.

[4] Li L，Tang F，Liu H，et al.Invivodelivery of silica nanorattle encapsulated docetaxel for liver cancer therapy with low toxicity and high efficacy[J].Acs Nano，2010，4(11)：6874-6882.

[5] 王佳丽，王秀，夏泉，等.莪术油中3种半萜类化合物对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的研究[J].中成药，2014，36(7)：1535-1539.

[6] 刘栋，吕祥，杜娟，等.淫羊藿素抑制人肝细胞癌BEL-7402细胞株新生血管机制研究[J].中医药导报，2014，20(5)：22-25.

[7] 张旭东，范引科，郭淑云，等.芝麻素抗肿瘤作用的研究[J].中国医药导报，2013，10(29)：101-104.

[8] 杨丽丽，王培胜，藤洪明，等.褐藻多糖硫酸酯诱导肝癌细胞凋亡中氧化应激作用[J].中国细胞生物学学报，2013，35(4)：437-441.

[9] 刘竹，韩凤娟，吴效科，等.莪术油的抗肿瘤及治疗卵巢癌的研究概况[J].现代中西医结合杂志，2010，19(17)：2209-2210.

[10] 宋爱莉，殷玉琨.莪术油干预治疗肿瘤的研究及应用概况[J].山东中医药大学学报，2008，32(2)：172-174.

[11] 陈家源，钟正贤，卢文杰，等.抗血栓药材醇提取物的筛选研究[J].广西医药，2009，31(8)：1067-1069.

[12] 王大伟，李秀荣，牛建超，等.淫羊藿素和脱水淫羊藿素对人类乳腺癌细胞T47D增殖和细胞周期的影响[J].北京中医药，2009，28(8)：637-640.

[13] 马丁丁，陈艳，黄尤光，等.淫羊藿素通过PI3K/AKT信号通路抑制非小细胞肺癌H460细胞增殖[J].现代肿瘤医学，2016，24(14)：2180-2183.

[14] 金永彪，车成日.芝麻素的生理功能研究的进展[J].大家健康，2014，8(5)：316-317.

[15] 刘宪丽，刘东颖，汪艳秋，等.褐藻多糖硫酸酯免疫调节和抗肿瘤活性研究[J].中国微生态学杂志，2010，22(12)：1074-1076.

(2016-06-12 收稿)

Comparison of Inhibitory Effect of Four Natural Medicines on Proliferation of HepG2 Cell Lines

Zhang Shuqin1，Hu Chiding2，Chen Xi3etal

1NeurologyDepartment，2OncologyDepartment，JianghanUniversityAffiliatedHospital，Wuhan430015，China3InfectionManagementDepartment，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To compare the effect of germacrone，sesamin，icaritin and fucoidan on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and study the underlying mechanism during those processes.Methods MTT assay was used to test the effect of the four natural medicines on proliferation of HepG2 cells.Apoptosis of the cells was detected by flow cytometry.The expression of several key proliferation- and apoptosis-related proteins was investigated by Western blotting.Results The four medicines inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner.The highest inhibition effect was induced by icaritin，and its IC50of 48 h treatment was 30 μmol/L.All the medicines induced apoptosis of HepG2 cells.Icaritin showed the most remarkable effect in inducing cell apoptosis.After treatment with 30 μmol/L icaritin for 48 h，apoptosis rate reached 51.1%.The medicines reduced the expression of Cyclin A，CyclinB1，CDK1，CDK2 and Bcl-2，and increased the protein expression of Bax.Conclusion The four medicines inhibit proliferation of HepG2 and induce its apoptosisinvitrosignificantly.The effect of icaritin is the most significant.The mechanism may be related with the regulation of several Cyclins，Bax and Bcl-2.

germacrone； sesamin； icaritin； fucoidan； HepG2 cell； proliferation； apoptosis

*武汉市科技攻关计划资助项目(No.201260523185)；华中科技大学教学研究基金资助项目(No.14058)

R735.7

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.018

张淑琴，女，1967生，副主任医师，E-mail：ltp670910@163.com

△通讯作者Corresponding author，E-mail：cmj@hust.edu.cn