糖尿病实验动物模型的研究进展*

张贤梅 江 波 孙勤国

武汉市第三医院中医科，武汉 430060

·文献综述·

糖尿病实验动物模型的研究进展*

张贤梅 江 波 孙勤国△

武汉市第三医院中医科，武汉 430060

据国际糖尿病联合会2015年发布《糖尿病地图》：目前，全球估计有4.15亿糖尿病患者，其中75%的糖尿病人群生活在中低收入国家，每6秒就有1人因糖尿病死亡，糖尿病消耗全球12%医疗费用，推测到2040年，全球糖尿病患病人数将达到42亿，其相关费用将突破8 020亿美元，中国患病人数将达1.1亿[1-2]。面对如此严峻的形式，必须做好糖尿病的三级预防，大家在探究最佳管理模式、最佳用药方案的同时，发病机制及新药的研究将是未来研究的主要方向之一，不论是发病机制探讨还是新药的开发都离不开实验动物模型的建立，目前国内外尚无统一的糖尿病模型建立标准，实验过程中多根据糖尿病临床表现、胰岛素依赖性、遗传特性等来建立糖尿病的近似实验动物模型。现就近几年相关文献报道对建立糖尿病动物模型的常用相关要点进行综述，期望在此有所参考。

1 实验动物的选择

1.1 自发性模型动物

自发性糖尿病模型动物是指由于先天性或遗传因素在自然条件下可发生糖尿病的动物，其发生、发展近似人类糖尿病病理改变过程。这些动物包括小鼠、大鼠、地鼠、非人灵长类动物、新西兰白兔、犬等，其中小鼠包括KK-Ay、ob/ob、db/db等单基因突变鼠、新西兰肥胖(New Zealand obese，NZO)小鼠、NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠等；大鼠包括GK(Goto Kakizaki)大鼠、Zucker(fa/fa)大鼠和OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty)大鼠等；地鼠以中国地鼠(Chinese hamster)为主，非人灵长类动物有猕猴、食蟹猴和树鼩等。常用类似人类1型糖尿病模型动物包括非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠、BB(bio breeding)大鼠、LETL(Long-Evans Tokushima lean)大鼠、新西兰白兔(New Zealand white rabbit)、荷兰毛狮犬(Keeshond dog)、中国仓鼠(Chinese hamster)等，其中以NOD小鼠、BB大鼠最多。ob/ob、db/db、Zucker、GK、KK-Ay等动物因具有高血糖、高胰岛素血症、高三酰甘油血症、胰岛素抵抗等类似人类2型糖尿病过程的主要特征[3]常被用于2型糖尿病模型动物。自发性的非人灵长类动物糖尿病病症非常类似人类2型糖尿病，但因其非常难得，很难广泛应用。这类动物因价格昂贵，饲养要求高，个体差异大在国内较少应用。

1.2 转基因模型动物

转基因动物主要是指用实验方法敲除内源基因或转入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物，这些敲除或者突变的基因会导致胰岛素受体的敏感性下降及胰岛素抵抗的发生。MKR小鼠因骨骼肌特异性胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)功能的缺失在出生5周后表现为明显胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能紊乱及脂代谢紊乱等，且其存活率高，是一种研究2型糖尿病的极好模型动物；GK/IRS-1为双基因剔除小鼠，表现2型糖尿病症状，既有胰岛素抵抗又有糖耐量异常；青幼年发病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)是2型糖尿病的一个亚型，有5种蛋白质的基因缺失或突变；MC4R(melanocortin 4 receptor)通过敲除MC4R基因建立的动物模型，可以用来研究具有肥胖、高胰岛素、高瘦素、贪食等特征的2型糖尿病[4-5]。这类动物因技术水平要求高，操作复杂，精密仪器配备齐全，价格非常昂贵，目前国内尚处于摸索阶段。

1.3 诱发性模型动物

诱发方法包括手术诱导、化学药物诱导和饮食诱导。手术诱导是切除全部或部分胰腺，造成糖尿病模型，狗、猪、兔和大鼠切除70%或90%胰腺能够造成糖尿病模型。化学药物诱导是通过链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、四氧嘧啶(alloxan，ALX)等药物注射至模型动物，破坏动物的胰岛功能而产生高血糖、胰岛素抵抗等，这些动物包括SD、Wistar大鼠，C57BL/6J小鼠、KM小鼠、长爪沙鼠、新西兰兔、恒河猴、Beagle犬、树鼩、云南省版纳微型猪等。至于这些种属区别，比较研究报道不多：35 mg/kg STZ一次性腹腔注射法显示Wistar大鼠造模结果优于SD大鼠[3]；70 mg/kg一次性尾静脉注射法显示ICR小鼠在成模率及血糖值方面均优于KM、NIH小鼠[6]；同等条件下STZ对C57比KM小鼠作用要缓慢[7]；C57BL/J6小鼠造模成功率较KM、ICR和BALB/c小鼠高[8]。特殊膳食诱导主要是给实验动物过量的食物或高蛋白、高脂、高糖饮食，使动物胰岛β细胞负荷过重发生萎缩而引发糖尿病，沙鼠、土古鼠和小非洲刺毛鼠是重要的膳食诱导的肥胖模型和2型糖尿病模型[9]。这类动物因价格相对便宜，耗时短，易于操作，现为国内较普遍的模型动物选择。手术诱导因手术操作复杂、耗时长、切除后胰岛的再生难以控制等，现已很少应用，目前国内外最常用的诱发方法为化学药物联合饮食诱导。

1.4 动物性别、体重的选择

夏旋等[10]认为雄鼠对STZ更敏感，发现8周龄雄大鼠成模率最高，小鼠性别对STZ敏感性依次为：雄小鼠>去势雄小鼠=去势雌小鼠>雌小鼠。李莉等[11]通过对SD大鼠腹腔注射STZ也得出雄鼠造模优于雌鼠的结论，分析认为这与性激素有关。叶华虎等[12]研究认为雌性动物较雄性动物对ALX更敏感，在使用ALX复制糖尿病模型时，雄性动物较雌性动物所需剂量通常要高20%左右。王晓琳等[13]则认为雄鼠对STZ的敏感性高于雌鼠，同时还得出不同性别大鼠可能建立不同类型糖尿病模型的结论，Wistar大鼠通过高脂饲料加腹腔注射25 mg/kg STZ造模，雌性大鼠可建立2型糖尿病模型，雄性大鼠则更类似1型糖尿病模型，明确提出低剂量STZ加膳食诱导方法要准确制备出2型糖尿病模型，必须选择雌性大鼠。奚清丽等[14]通过优化组合认为体重27～29 g的雄性小鼠腹腔注射ALX后成模率较高、死亡率较低，是血糖持续较稳定的糖尿病小鼠模型。刘鸥飞等[15]研究认为体重在151～200 g的大鼠对ALX的敏感性最高，造模成功率最大，死亡率最低。

2 实验动物的饮食

多数文献报道高脂饮食更能模拟糖尿病模型特点，认为高脂食物调控FOXA2和HNFlA两个关键蛋白，扰乱胰岛素分泌β细胞和监控血糖浓度的能力，通过高脂饮食造成外周组织对胰岛素不敏感，还有高血脂，再加小剂量化学诱导剂导致胰岛的病理改变，造成胰岛损伤，最终导致高血糖症的发生。其配方是在普通饲料基础上加一定比例的猪油、蔗糖、胆固醇、蛋黄粉、胆酸盐、奶粉等。喂养时间一般是4～12周，因种属差别、饲料配方比例不同而有差异，最长有云南省版纳微型猪喂养达12个月之久。朱超等[3]认为高脂高糖饲养时间长短与STZ剂量大小关系很大，考虑到动物的年龄及造模后续的实验时间，建议高脂高糖饲养时间4周左右为宜。王保伟等[16]给予大鼠高脂饲料喂养4周后腹腔注射STZ 30 mg/kg，成模率高达85%，喂养8周后腹腔注射相同体质量STZ，死亡率达65%，10周后体重增长速度明显降低。蔡爽等[17]则认为高脂高糖饮食饲养6周后小剂量STZ注射效果最好。孙丽华等[18]研究强调单纯注射STZ或高脂高糖饮食不能复制理想的糖尿病模型，二者对血糖异常具有相互促进作用，同样认为高糖高脂膳食6周后血糖升高显著，血清胰岛素水平降低。

3 诱导剂的应用

3.1 诱导剂的选择及优化

目前常用诱导剂有STZ和ALX，亦有较少文献报道金硫葡萄糖(gold thioglucose，GTG)、D-半乳糖、谷氨酸钠、地塞米松、氢化可的松等。STZ致糖尿病的基本机制可能在于β细胞通过胞膜葡萄糖转运体2(GLUT-2)摄取STZ，STZ可能通过氧化氨和(或)甲基化损伤DNA，NO可以诱导β细胞凋亡，DNA损伤使得多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)过度激活而使β细胞因能量衰竭而死亡和伴发糖尿病神经、心肌并发症，STZ更可能通过抑制氮乙酰葡萄糖胺糖苷酶(OGN)使得乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)堆积，影响胰岛素的释放[8]。联合烟酰胺或抑制醛糖还原酶效果更好，刘斌等[19]应用STZ联合烟酰胺(腹腔注射烟酰胺60 mg/kg，15 min后腹腔注射STZ 65 mg/kg)诱导糖尿病Wistar大鼠成功率比单独诱导组(腹腔注射与烟酰胺等量的生理盐水，15 min后腹腔注射65 mg/kgSTZ)高，死亡率低，认为烟酰胺可以保护胰岛功能，使胰岛素功能部分保留，使动物最大程度的产生中等的、稳定的高血糖症。梁佳欣[20]认为抑制醛糖还原酶对小剂量多次注射STZ诱导的l型糖尿病小鼠模型有显著保护作用。ALX导致糖尿病机制认为是其游离氧基能氧化β细胞的DNA单链，使染色体发生异常，引起细胞畸变，并能抑制β细胞的多种代谢，增强其细胞膜的通透性而破坏β细胞。有研究[21]认为以STZ联合ALX(40 mg/kg×4 d+100 mg/kg×1 d)可提高造模成功率，单独使用ALX(220 mg/kg)造模成功率较低，单独使用STZ(40 mg/kg×4 d)造模成功率居中，而总胆固醇偏高。综合比较，STZ造模优于ALX，STZ半衰期较长(15 min)，具有造模稳定、快速、种属选择性不强(豚鼠只能用STZ造模)、组织毒性相对较小、致死率较低等优点，但其价格较ALX贵[7]。二者缓冲液均用PH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作溶媒，较生理盐水作溶媒的成模率明显增高，要求现配，避光，冰浴保存[22]。

3.2 诱导剂的干预方式及时间

诱导剂的干预方式有腹腔注射和静脉注射2种，其中静脉注射包括耳缘静脉(兔)、尾静脉(鼠)、下肢浅静脉(犬)。一般认为静脉给药效果优于腹腔给药，何学令等[23]以3%ALX静脉给药较腹腔给药表现出明显的“三多一少”症状，ALX的血浆半衰期仅1～2 min，故注射越快成模率越高。注射STZ时，盐水导入(即尾静脉给药前先导入盐水再推STZ溶液)可以大幅度降低STZ尾静脉注射造模时的死亡率(6.52%)，提高成模率(73.9%)。干预时间，一般认为空腹给药效果好，空腹给药可以增加胰岛细胞对诱导剂的敏感性，用较低的药物剂量就可以破坏胰岛功能。一般禁食时间10～16 h为宜[24-27]。

3.3 诱导剂的给予频次

综合文献分析，不管是ALX还是STZ，小剂量多次注射和大剂量单次注射均能获得糖尿病模型，但单次大剂量注射造成的生理变化和血糖波动比小剂量多次注射更为剧烈[28]。韦立顺等[29]用1%STZ溶液按照150 mg/kg一次性腹腔注射35～40 g雄性昆明种小鼠，造模成功率83.3%，血糖在1～8周内均维持在较高水平，且胰腺和肾脏出现组织形态变化。70 mg/kg×5 d STZ诱导的糖尿病模型成功率高，死亡率低，且很稳定，至少可以维持12周[30]。孟建波等[31]用5%ALX给新西兰兔连续2次小剂量(第1次按80 mg/kg，24 h后按120 mg/kg)经耳缘静脉快速注射给药，其效果优于一次性(150 mg/kg)高剂量给药。此外，有报道[32]采用大剂量一次性注射的给药方法，建立的大鼠模型与人类l型糖尿病相似，采用小剂量分次给药的方法，建立的大鼠模型与人类2型糖尿病相似。

3.4 诱导剂的给予剂量

至于剂量则因种属差异、饮食搭配、实验设计、模型判定标准不同而不同。成雪等[33]研究认为50 mg/kgALX为制备Beagle犬糖尿病模型的一次性腹腔注射的最佳剂量。在高脂饲料喂养4周基础上，125 mg/kgSTZ一次性腹腔注射雌性KM小鼠造模效果最佳[34]。45 mg/kg是短期高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射建立2型糖尿病Wistar大鼠模型的最佳注射剂量[35]。50 mg/kg的STZ注射雄性恒河猴，虽成模率不如70 mg/kg，但可使该动物模型疾病病程延长，其维持高血糖状态达1年余[36]。在高糖高脂饲料喂养5周后，25 mg/kg×2 d STZ腹腔注射SD大鼠，可建立大鼠2型糖尿病模型[37]。樊志奇等[38]研究认为50 mg/kg×3 d尾静脉注射1%ALX是18～22 g小鼠最佳制备小鼠糖尿病模型的方法。高脂高糖饲料喂养4周后，认为70 mg/kg的STZ为KM鼠和C57鼠最佳腹腔注射剂量[5]。

4 成模标准的判定

目前，国内外对糖尿病模型成功标准尚无统一规定，多数除了观察实验动物“三多一少”症状外，根据文献或设置空白对照组进行比较，有用空腹血糖≥6.1 mmol/L，和(或)随机血糖或OGTT 2 h≥11.1 mmol/L，以随机血糖≥16.7 mmol/L居多，且持续4～12周，作为模型成功的标准，单纯研究模型还可测定血清胰岛素、血脂、尿糖或镜下观察模型动物胰腺组织形态学变化，与空白组对照来判定模型成功与否。具体则因实验动物的饮食、禁食时间、动物种属等的差异而有所不同。韦立顺等[29]以小鼠禁食12 h尾尖取血测血糖≥16.7 mmol/L，并镜下观察胰腺及肾脏组织形态学变化为标准探索实验性糖尿病模型的建立方法。王嘉惠等[39]在高脂饮食联合STZ诱导SD大鼠，以空腹血糖≥7.0 mmol/L作为模型成功标准，并以OGTT、胰岛素敏感指数等评价模型稳定性和有效性。

5 展望

糖尿病实验动物模型的建立是研究糖尿病及其并发症发病机制、药学代谢及作用机制等的基础，也是实验研究的关键环节。根据目前研究报道，多数选择小剂量多次腹腔注射STZ诱导高脂饮食4～6周的SD、Wistar大鼠及C57BL/6J、KM小鼠的造模方式。在具体研究过程中，常有实验动物种属、诱导方法、实验条件以及技术等的差别和限制，无法确定同一种属在特定条件下使用诱导剂的量、方式、时间以及最终成模情况。在此，有望在糖尿病模型研究方面有统一的参考方法和判定标准，为糖尿病及其并发症相关方面的研究奠定更稳固的基石。

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10.3969/j.issn.1674-4616.2017.02.018

*湖北省武汉市卫计委科研项目(No.WZ14A02)

2017-01-21)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：sunqg0919@qq.com