姜黄素通过下调m icroRNA-211表达促进结肠癌细胞的凋亡及其机制

武嘉庚

（青海省药品检验检测院藏药室，青海西宁810000）

姜黄素通过下调m icroRNA-211表达促进结肠癌细胞的凋亡及其机制

武嘉庚

（青海省药品检验检测院藏药室，青海西宁810000）

目的检测姜黄素对结肠癌细胞中微小RNA 211（m icroRNA 211，m iR-211）表达的影响并探讨miR-211调控结肠癌细胞增殖和凋亡的可能机制。方法使用MTT法和流式细胞术检测不同浓度姜黄素在不同时间点对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响；使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同浓度姜黄素对结肠癌细胞中m iR-211表达的影响；使用生物信息学预测m iR-211下游靶基因TP53INP1并使用荧光素酶报告基因法验证其结合；用m iR-211模拟物（m iR-211 m im ics）检测其对姜黄素处理的结肠癌细胞增殖的影响，同时使用W estern blot法检测其对TP53INP1蛋白表达的影响；用TP53INP1小干扰RNA检测其对姜黄素处理的结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。结果相较于未处理组，姜黄素在10～50μmol/L浓度可抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡（P<0.05）。姜黄素可抑制肿瘤细胞中miR-211的表达，并具有时间和剂量依赖性（P<0.05）；此外，miR-211下游靶基因TP53INP1蛋白表达量上调（P<0.05）。用miR-211转染结肠癌细胞可逆转姜黄素对其增殖的抑制作用，并且TP53INP1表达下调（P<0.05）；用TP53INP1小干扰RNA可逆转姜黄素对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响（P<0.05）。结论姜黄素可通过下调m iR-211抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡，并且TP53INP1是m iR-211下游调控蛋白之一。

结肠癌；m iR-211；姜黄素；TP53INP1；凋亡

结肠癌在全球范围内是肿瘤引起死亡的重要原因之一[1]，并且其发生率逐年升高。由于早期筛查经济成本受限，大部分明确诊断的结肠癌均处于晚期阶段。虽然目前治疗手段不断改善，但结肠癌的预后仍旧不佳。因此，新的治疗方式仍需不断开发。

植物提取的化学物质由于其抗肿瘤特点受到广泛关注。姜黄素作为一种提纯的中药单体，研究发现具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤等。在多种肿瘤的研究中发现，姜黄素可明显抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，但具体分子机制研究不清[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是体内一种非编码RNA，在细胞增殖、凋亡、分化等过程中发挥重要作用。近年来研究发现，miRNA异常表达跟肿瘤的发生、发展密切相关[3]；并且姜黄素可调控miRNA表达影响肿瘤的进展。MicroRNA 211（miR-211）在肿瘤发生、发展过程中具有重要作用，但姜黄素能否通过调控miR-211表达影响肿瘤进展尚不明确。本研究旨在探讨miR-211在姜黄素抑制结肠癌细胞HCT116增殖和凋亡中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞系HCT116（凯基公司，中国），DMEM培养基（Invitrogen公司，美国），血清（Hyclone公司，美国），姜黄素（Sigma公司，美国），MTT粉（Sigma公司，美国），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（上海生物工程有限公司，中国），双荧光素酶报告基因表达质粒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega公司，美国），Trizol、逆转录试剂盒以及实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程公司，中国）。miR-211正向引物5'-CTGCTTGGACCTGTGA CCTGT-3'，反向引物5'-TCTGCAGTAGAGGTGACCA-3'；U6正向引物5'-GCTTCGGCAGCACATATAC TAAAAT-3'，反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT-3'，均由宝生物工程合成。miR-211模拟物（miR-211 mimics）、miR-211下游靶基因TP53INP1（tumor protein P53-inducible nucle ar protein 1，TP53INP1）siRNA构建以及转染试剂盒（锐博公司，中国），TP53INP1兔抗人单克隆抗体（Abcam公司，英国），抗β-actin多克隆抗体、二抗（凯基公司，中国），PVDF膜（Millipore公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理使用DMEM培养基培养HCT116细胞，培养基含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素；培养条件：37℃，5%二氧化碳CO2。当细胞生长至70%～80%融合时，细胞给予不同浓度姜黄素（10、20、30、40和50μmol/L）处理不同时间（6、12、24和48 h），检测其增殖和凋亡情况。

1.2.2 MTT检测细胞增殖HCT116细胞（5 000个/孔）种植于96孔板中，培养过夜便于贴附；加入不同浓度姜黄素，分别于不同时间点用MTT法检测细胞活力。未处理组细胞作为阴性对照。每孔加入5mg/m l MTT 20μl，继续培养4 h；弃去培养液终止反应，每孔加入150μl DMSO溶解蓝紫色沉淀，低速震荡10min；在波长490 nm处检测吸光度值。结果分析以未处理组为100%，计算抑制率。每组试验重复3次。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡HCT166细胞以10 000个细胞/孔种植于96孔板中，培养过夜便于贴附；加入不同浓度姜黄素培养12 h或者加入30μmol/L姜黄素培养不同时间。未处理组细胞作为阴性对照。胰酶消化细胞，PBS洗涤，加入300μl结合液重悬，加入10μl Annexin V-FITC室温避光孵育15min，上机前加入5μl PI，并补充200μl结合液，流式细胞仪上机检测。Annexin V阳性细胞为凋亡细胞。所有试验重复3次。

1.2.4 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测细胞中m iR-211表达实验分为3部分：总RNA的提取、RNA逆转录成cDNA、实时荧光定量PCR。总RNA提取使用Trizol法：当细胞生长至培养瓶80%～90%时，弃去培养基，PBS洗涤，加入1m l Trizol裂解细胞，转移至EP管，静置5min；加入氯仿200μl，震荡15 s，室温静置5min，离心取上清；加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10min，离心；弃上清液，加入预冷75%乙醇1ml洗涤，弃上清；加入DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度计检测吸光度，计算RNA浓度。逆转录按照试剂盒说明书要求进行操作：反应体系20μl，其中5×Prime Script Buffer 4μl，逆转录酶1μl，预混引物1μl，RNA 1μg；反应条件42℃30min，85℃5 s；cDNA冷冻保存。qRT-PCR在ABI7500 Fast上进行，反应体系按照说明书操作；两步法扩增，预变性阶段95℃30 s1个循环；PCR反应阶段：95℃3 s，60℃30 s，40个循环。结果分析根据miR-211和U6测出的CT值差异，采用ΔΔCT法计算miR-211相对表达量。所有试验重复3次。

1.2.5 细胞转染对于TP53INP1敲除实验，HCT116细胞按105个/孔种植于6孔板中，DMEM完全培养基培养24 h后，无血清培养基冲洗；根据转染操作说明瞬时转染TP53INP1 siRNA和对照siRNA。对于miR-211过表达实验，人miR-211mimics，分别转染进入HCT116细胞。转染24 h后加入40μmol/L姜黄素处理24 h，收集细胞进一步分析。

1.2.6 W estern blot检测TP53INP1蛋白表达HCT116细胞处理后加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解细胞，冰上作用40min，10 000 r/min 15min，获得上清液；根据BCA法测定蛋白浓度；蛋白样本处理：加入1/5体积5×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀，100℃煮沸5min；电泳：制备SDS-PAGE凝胶，根据蛋白浓度每孔加入一定量蛋白样本，电泳；转膜：切胶并剪下相应大小PVDF膜，在转膜液用一定电流将蛋白转入PVDF膜上；脱脂奶粉封闭非特异性位点；一抗anti-TP53INP1（1∶1 000），anti-β-actin（1∶2 000）4℃孵育过夜；二抗孵育；显色反应。结果采用Image J软件计算灰度值进行数据分析。所有试验重复3次。

1.2.7 荧光素酶报告基因法检测m iR-211与靶基因TP53INP1的结合pGL3-TP53INP1-3’UTR和pGL3-TP53INP1-3’UTR mutant质粒购自Promega公司。在转染前，HCT116细胞按105个/孔接种于24孔板中，培养24 h。根据检测试剂盒说明书操作，荧光素酶报告基因表达质粒和pRL-TK共同转染细胞，同时给予miR-211 mimics和对照组。24h后检测荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性根据相应海肾荧光素酶活性进行标化。所有试验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，在方差分析有统计学意义的基础上，再行LSD-t检验（两浓度组间）或配对t检验（两时间点间）进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对结肠癌细胞HCT116增殖和凋亡的影响

HCT116结肠癌细胞用不同浓度姜黄素（10、20、30、40和50μmol/L）处理，不同时间（6、12、24和48h）细胞活性用MTT法检测。结果显示（见图1A），相较于未处理组，10～50μmol/L浓度姜黄素对HCT116均有不同程度抑制，随着剂量的增加抑制率上升，随着处理时间的延长抑制率同样逐渐增加；其中24和48 h抑制效应显著增加，分别是17%～55%和20%～76%（P<0.05）。

用流式细胞术检测姜黄素对HCT116细胞凋亡的影响。不同浓度姜黄素处理24 h后，结果显示（见图1B），10～50μmol/L姜黄素对HCT116凋亡均有不同程度促进（9.25%～42.34%，P<0.05）。30μmol/L姜黄素处理不同时间结果显示（见图1C），随着时间延长，姜黄素促进凋亡效应逐渐增加（6.34%～32.23%，P<0.05）。

2.2 姜黄素对HCT116细胞m iR-211表达的影响

HCT116细胞用不同浓度姜黄素处理24h后，收集细胞，用qRT-PCR法检测HCT116细胞中miR-211的表达。结果显示（见图2），相较于未处理组，10～50μmol/L姜黄素均可抑制miR-211的表达，且具有剂量依赖性（14%～62%，P<0.05）。

2.3 MiR-211下游靶基因的预测及验证

为了进一步研究miR-211对HCT116细胞增殖和凋亡的影响，采用生物信息学方法，用Target Scan数据库筛选miR-211跟增殖和凋亡相关的下游靶基因。结合文献分析，本研究选择TP53INP1作为miR-211潜在下游靶基因。为了验证预测的TP53INP1是否为miR-211靶基因，能否和TP53INP1的3’UTR结合，将miR-211mimics与构建的TP53INP1-wt、TP53INP1-mut质粒转染HCT116细胞，24 h后检测荧光素酶活性。结果显示（见图3），相较于对照组，miR-211mimics可抑制TP53INP1-wt载体荧光素酶活性（抑制率为41%，P<0.05），而对TP53INP1-mut荧光素酶活性无明显影响。实验结果与数据库预测结果一致，说明miR-211可以和TP53INP1 3’UTR结合。

图1 不同浓度姜黄素处理HCT116不同时间对其增殖和凋亡的影响

2.4 过表达m iR-211对HCT116细胞TP53INP1蛋白表达和增殖的影响

检测高表达miR-211对姜黄素处理的HCT116细胞生物学活性的影响。Western blot结果显示（见图4A），相较于对照组，高表达miR-211可抑制姜黄素处理组HCT116细胞TP53INP1蛋白水平的表达（P<0.05）。MTT结果显示（见图4B），相较于姜黄素处理组，高表达miR-211可缓解姜黄素对HCT116细胞增殖的抑制作用（P<0.05）。

图2 不同浓度姜黄素对HCT116细胞中m iR-211表达的影响

图3 m iR-211作用于TP53INP1 3’UTR抑制荧光素酶活性

2.5 抑制TP53INP1基因表达对HCT116细胞增殖和凋亡的影响

用siRNA技术研究TP53INP1在姜黄素抗肿瘤效应中的作用。用TP53INP1 siRNA和对照siRNA分别转染HCT116细胞，再给予40μmol/L姜黄素作用24 h，MTT结果显示（见图5A），相较于对照组，TP53INP1 siRNA组可逆转姜黄素对HCT116的抑制效应（P<0.05）。凋亡实验结果显示（见图5B），相较于对照组，TP53INP1 siRNA组可抑制姜黄素促进HCT116细胞凋亡作用（P<0.05）。

图4 高表达m iR-211对HCT116细胞TP53INP1蛋白表达和增殖的影响

图5 TP53INP1 siRNA对HCT116细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

姜黄素作为一种中药提纯的单体，具有明确的抗肿瘤作用。研究发现，姜黄素可通过作用NF-κB、Notch、P53、Caspase-3、细胞周期蛋白D1等途径促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖[4-5]，但具体分子机制尚不清楚。本实验结果发现，姜黄素可促进结肠癌细胞HCT116的增殖并抑制其凋亡，效应具有时间和剂量依赖的特点。

miRNA是长度约22个核苷酸左右的单链非编码RNA序列，主要通过结合目标mRNA 3’UTR非编码区来抑制其功能，从而促进其降解或者抑制蛋白翻译。在肿瘤学研究中，异常的miRNA表达跟肿瘤的发生、发展密切相关[3]。计算机模拟预测发现每个miRNA可调节多个靶基因，并且人类超过50%编码基因都可受到miRNA调控。因此，不同肿瘤miRNA表达特征可作为潜在的早期诊断、治疗以及预后判断的重要指标。近期的研究发现，姜黄素的抗肿瘤效应和miRNA的表达密切相关。在胰腺癌的研究中，MA等[6]发现姜黄素可上调miR-7表达，从而下调组蛋白甲基转移酶抑制肿瘤细胞生长和侵袭转移。在非小细胞肺癌研究中，ZHANG等[7]发现，姜黄素可通过下调miR-186促进A549细胞凋亡。在膀胱癌研究中，SAINI等[8]发现，姜黄素可通过调节miR-203影响Src-Akt轴抑制肿瘤。该研究显示，姜黄素通过调节miRNA表达是其抗肿瘤的重要机制之一。因此，筛选出姜黄素在不同肿瘤中特异性调节的miRNA分子是肿瘤靶向治疗重要方向。

结肠癌在全球范围内具有较高的发生率和死亡率。近年来的研究发现，miRNA和结肠癌发生、发展密切相关。ASANGANI等[9]首次发现miR-21可促进肿瘤侵袭转移，并且结肠癌中高表达的miR-21可通过转录后调节的方式抑制抑癌基因程序性细胞凋亡因子4表达。ZHANG等[10]通过高通量测序分析结肠癌患者miRNA表达谱差异，筛选出得特异性miRNA可预测术后化疗效果并可判断复发情况。姜黄素调控结肠癌miRNA表达主要研究的是miR-21，对其他miRNA研究不多，本研究主要就miR-211进行研究。

miR-211在不同肿瘤中具有不同作用特点。CHANG等[11]发现在口腔肿瘤中miR-211高表达，并且其与肿瘤预后不佳相关。在胰腺癌研究中发现[12]，低表达miR-211的患者具有更短的中位生存时间，但具体机制不清。CAI等[13]在结直肠癌研究中发现，miR-211可通过下调抑癌基因染色质域解旋酶DNA结合蛋白5促进肿瘤生长。本实验研究发现，结肠癌细胞HCT116高表达miR-211，并且姜黄素可抑制miR-211表达，效应具有剂量依赖性。

研究已报道多个miR-211下游靶基因，如Brn2（brain 2）[14]、NUAK1（NUAK family SNF1-like kinase 1）[15]、TGFβRⅡ（transforming growth factorβreceptorⅡ）等[16]，这些靶基因具有不同生物学功能。本研究采用Target Scan数据库筛选miR-211下游靶基因，发现TP53INP1（Tumor protein P53-inducible nuclear protein 1）可作为候选靶基因。TP53INP1是一种抑癌基因，在多种肿瘤组织中表达下调，可调控P53活化状态，跟细胞死亡、细胞周期停滞以及细胞迁移密切相关[17]。SEUX等[18]研究发现，TP53INP1可调控分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）的表达抑制胰腺癌细胞侵袭转移。在肝癌中研究发现[19]，上调的miR-182可通过下调TP53INP1，从而增加肿瘤耐药。因此，笔者推测TP53INP1的表达增高跟姜黄素诱导的HCT116凋亡有关。实验结果表明，姜黄素处理后TP53INP1蛋白表达增高，并且干扰TP53INP1表达能促进HCT116细胞增殖、抑制其凋亡。

综上所述，miR-211在调控姜黄素的抗肿瘤效应方面具有重要作用，其机制可能是通过下调TP53INP1蛋白表达，从而促进肿瘤细胞增殖、抑制其凋亡。

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（张蕾编辑）

Curcum in promotes apoptosis in colon cancer by downregulating m iR-211 expression

Jia-gengWu
(Tibetan Medicine Room,Qinghai Provincial Drug Inspection and Testing Institute, Xining,Qinghai810000,China)

ObjectiveTo study the effect of curcumin on miR-211 in colon cancer cells and clarify amiR-211-mediated mechanism which plays a role in the anti-tumor effects of curcumin.MethodsThe dose-effect and timeeffect relationship of curcumin on HCT116 was tested by MTT assay and flow cytometry.Expression level ofmiR-211 in curcumin-treated HCT116 was detected by qRT-PCR.TP53INP1 was predicted as a target ofmiR-211 using GeneTarget database and confirmed by dual luciferase reporter assays.Additionally,the effect of upregulatingmiR-211 bymiR-211 mimics or silencing TP53INP1 by siRNA on curcumin-treated HCT116 was examed by MTT and flow cytometry.ResultsCompared with untreated HCT116 cells,curcumin at 10-50μmol/L inhibited cell proliferation and induced apoptosis in a dose-dependent and time-dependentmanner.Curcumin also produced a dose and time dependent suppression of miR-211(P＜0.05).Moreover,the protein level of TP53INP1 was significantly elevated in crucumin-treated HCT116 cells(P＜0.05).Transfection of HCT116 withmiR-211mimicsor TP53INP1 small interfering RNA significantly reversed the effect of curcumin on HCT116,compared to corresponding controls(P＜0.05).ConclusionsOur data suggesta novelmolecularmechanism in which inhibition of miR-211 and upregulation of TP53INP1mediate the anticancer activities of curcumin in colon cancer cells.

colon cancer;miR-211;curcumin;TP53INP1;apoptosis

R 735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.004

1005-8982（2016）24-0018-06

2016-07-06