基于环介导等温扩增技术建立的假丝酵母菌快速检测方法*

林江，温先勇，林雁，邓正华，黄远帅

（西南医科大学附属医院检验科，四川泸州646000）

基于环介导等温扩增技术建立的假丝酵母菌快速检测方法*

林江，温先勇，林雁，邓正华，黄远帅

（西南医科大学附属医院检验科，四川泸州646000）

目的基于环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种假丝酵母菌的快速检测方法。方法依据假丝酵母属18SrDNA基因保守序列，采用PrimerExplorerV4软件设计引物，建立LAMP扩增方法和反应体系，对体系的4种关键参数和3项性能指标进行优化和探讨，并用临床样本进行方法验证。结果6种常见假丝酵母菌LAMP法检测均为阳性；最适扩增条件为：温度63～65℃、Bst酶活性4IU、Mg2+浓度4mol/L、扩增时间1h；7种对照菌种及人全血DNA样本LAMP扩增结果均为阴性；检测限为102～107CFU/ml。经52例临床样本验证，该法敏感性为100%，特异性为95%。结论该研究建立的LAMP假丝酵母菌检测方法具有实用、简便、快速、特异和敏感的特点，可为临床提供一种新的假丝酵母菌诊断方法。

假丝酵母菌；环介导等温扩增；检测方法

近年来，由于广谱抗生素的使用、侵袭性技术广泛开展及免疫力低下人群的不断增加，真菌感染的发病率呈逐年上升趋势，其中常见假丝酵母菌（白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌及季假丝酵母菌）感染已占了真菌感染的85%~91%[1]。实验室常用诊断方法为培养和组织病理学方法，该类方法耗时长、阳性率低、有创性，远不能满足临床需要。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术，近期在细菌和病毒研究领域中发展迅速，但真菌研究方面的资料却不多见。为此，本研究根据LAMP基本原理建立假丝酵母菌快速检测方法，旨在为临床快速检测假丝酵母菌提供一种手段。

1 材料与方法

1.1 实验菌株及对照菌株

实验菌株：白色假丝酵母菌（2.4159）、热带假丝酵母菌（2.1028）、近平滑假丝酵母菌（2.4312）、克柔假丝酵母菌（2.3196）、光滑假丝酵母菌（2.3983）、季也蒙假丝酵母菌（2.3204）；对照菌株：大肠埃希菌（1.8732）、金黄色葡萄球菌（1.8721）、铜绿假单胞菌（1.10712）、肺炎克雷伯菌（1.10617），以上菌株由中科院微生物研究所提供；隐球菌、毛霉菌、青霉菌由西南医科大学微生物室提供。

临床样本：共52份（假丝酵母菌感染样本32份，非假丝酵母菌感染样本20份），标本包括为血液、脓液、脑脊液、分泌物等，选取2015年2月-2016年5月西南医科大学附属医院血液内科、肿瘤科、感染科、ICU病房、新生儿科急门诊患者，感染菌种经镜检、细菌培养、组织病理学、影像学、血清学及临床资料证实。

1.2 主要试剂与仪器

DNA提取试剂盒（深圳凯杰生物有限公司公司），朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒、朗报荧光目视检测试剂盒[荣研生物科技（中国）有限公司]，血琼脂培养基、巧克力选择培养基、沙保弱培养基（重庆庞通医疗器械有限公司）。恒温水浴锅（成都赛可隆机械设备有限公司），1300seriesA2生物安全柜（苏州赛摩飞世尔仪器有限公司），高速冷冻台式离心机（美国THERMO公司），HB-100恒温金属浴锅（杭州博目科技有限公司），C1000梯度PCR扩增仪（美国白乐有限公司），WD-9403L紫外分析仪、DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.3 引物设计

针对6种临床常见假丝酵母菌（白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌），依据其18SrDNA基因序列，使用primerexplorer.jp/elamp4.0软件在线设计LAMP引物，并由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 假丝酵母菌属LAMP引物序列

1.4 菌株DNA提取

活化冷冻保存（-80℃）菌株恢复培养，将菌株接种至沙保若培养基（血平板），非假丝酵母菌属源真菌于28℃、假丝酵母（或细菌）于37℃，培养2～5d。挑取一定量的单个纯菌落至1.0ml的无菌生理盐水EP管中。将上述EP管中的菌悬液按10倍倍比稀释至所需浓度（以平板倾注培养法验证稀释后各管浓度并进行浓度调整）。采用凯杰公司DNA提取试剂盒对模板DNA进行提取，操作步骤按说明书严格进行。

1.5 LAMP方法的建立及验证

1.5.1 LAMP扩增体系组成参照荣研产品试剂盒说明书，建立LAMP反应体系（26.0μl）：2×LAMP反应缓冲液12.5μl，4种设计引物（25.0μmol/L的FIP和BIP各1.6μl，5μmol/L的F3和B3各1.0μl），BstDNA聚合酶1.0μl，荧光染料1.0μl，纯水补至24.0μl。阴阳性对照反应体系：2×LAMP反应缓冲液12.5μl，BstDNA聚合酶1.0μl，荧光染料1.0μl，2.5μl模板，纯水补至24.0μl。实验组加入已制备的DNA模板液2.0μl，阴阳对照组各加入去离子水和阳性对照液各2.0μl。扩增条件：65℃水浴1h，80℃、5min灭活BstDNA聚合酶终止反应。反应结果用紫外线观察（或肉眼），阳性显示为亮绿色荧光，阴性无荧光（橙红色）。

1.5.2 LAMP方法的验证利用1.5.1建立的方法对6种假丝酵母菌属常见菌种进行LAMP扩增后肉眼观察结果。

1.6 反应体系优化

根据设计引物的理论退火温度值，选择温度（56、59、62、65、68、71、74和77℃）、Bst酶活性（8IU、4IU）、Mg2+浓度（2、4和6mmol/L）及反应时间（30、45、60和90min）等参数，以白色假丝酵母DNA为模板进行LAMP扩增，以确定最佳反应条件。

1.7 LAMP方法特异性、敏感性及检测限的检测

1.7.1 LAMP方法特异性利用建立的LAMP方法对1.1中的6种实验菌株、4种对照菌株、3种非假丝酵母真菌菌株以及人全血DNA进行LAMP扩增，以评估建立LAMP方法的特异性。

1.7.2 LAMP方法的敏感性及检测限将白色假丝酵母菌培养，按1.4方法稀释，制备100～107CFU/m l浓度的菌悬液，以建立的LAMP体系进行扩增，观察检测敏感性和检测限。

1.8 LAMP方法的临床样本验证

对临床证实的假丝酵母菌感染样品32份及其他细菌感染样品20份进行传统培养和LAMP扩增检测，比较其阳性率、敏感性及特异性的差异。

1.9 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件行统计学分析，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P< 0.05为差异有统计学意义。LAMP快速检测方法采用敏感性、特异性等指标加以评价。

2 结果

2.1 6种常见假丝酵母菌LAMP检测结果

利用建立的LAMP扩增体系对白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌等6种假丝酵母菌扩增，荧光观察见图1，结果见表2所示，6种常见假丝酵母菌均呈阳性。

2.2 LAMP反应体系优化

图1 6种常见假丝酵母菌LAMP扩增荧光效果图

表2 6种假丝酵母菌LAMP扩增结果

反应温度、Bst酶浓度、Mg2+浓度、反应时间等参数优化结果见图2~5。图2显示，在71～77℃内产物荧光极弱；在56～68℃温度范围内荧光明亮，其中在63～65℃荧光强度最强，故确定LAMP扩增适宜温度为63～65℃。图3显示，在最适65℃温度条件下，Bst酶浓度分别为8 IU、4 IU LAMP扩增荧光观察结果差异无统计学意义，因成本因素，确定LAMP扩增采用4 IU Bst酶。图4显示，在65℃退火温度和4 IU Bst酶活性条件下，Mg2+浓度分别为2、4和6mmol/L时，以Mg2+浓度为4mmol/L时荧光强度最强。图5显示，在65℃，4 IU Bst酶活性、4mmol/L的Mg2+浓度条件下，反应时间分别为30、45、60和90min时，60和90min荧光强度均强，为缩短反应时间，故选择60min为适宜扩增反应时间。

2.3 LAMP方法的特异性、敏感性和检测限

2.3.1 LAMP方法特异性6种假丝酵母菌和7种对照菌株及人全血DNA LAMP扩增结果见图6，其电泳结果见图7，结果显示，6种假丝酵母菌及阳性对照均呈阳性；对照菌株、人全血DNA及阴性对照均呈阴性；由于LAMP扩增产物是由多种大小不同片段组成，电泳结果显示，扩增结果符合LAMP扩增产物特征。

图2 温度对LAMP扩增影响荧光效果图

图3 Bst酶活性对LAMP扩增影响荧光效果图

2.3.2 LAMP方法敏感性及检测限将按1.4方法稀释、提取的白色假丝酵母菌模板进LAMP扩增，荧光结果（见图8）显示，102～107CFU/ml浓度的模板均表达为强荧光，检测范围为102～107CFU/ml。见表3。

图4 Mg2+浓度对LAMP扩增影响荧光效果图

图5 反应时间对LAMP扩增影响荧光效果图

图6 假丝酵母菌对照菌株及人全血DNALAMP扩增结果

图7 LAMP特异性检测电泳效果图

2.4 LAMP方法的临床样本验证

对经临床证实的32份假丝酵母菌及20份非假丝酵母菌感染样品分别进行培养和LAMP检测，其结果见表4。

表4显示，与传统培养法比较，LAMP检测法阳性率（χ2=9.861，P=0.000）和敏感性均有提高（χ2=19.591，P=0.000），检测时间为1.5～2.0h，也远远短于培养法的24～48h。

图8 LAMP敏感性检测荧光效果图

表3 LAMP扩增不同浓度梯度DNA模板检测结果

表4 临床样品培养与LAMP检测结果比较（n=52）

3 讨论

真菌属于人体正常菌群，当人免疫力降低时容易造成感染，而其中假丝酵母菌占绝大部分[2]。由于该病起病隐匿，早期诊断困难，病情进展迅速，死亡率高[3]，所以临床上迫切需要一种早期、快速的真菌检测方法。

LAMP技术是近年来迅速发展起来的一种分子诊断技术，它依赖于链置换酶（Bst酶）在恒温水浴锅条件下快速、高效的扩增核酸，具有广泛的应用前景[4]。

LAMP扩增技术成败的关键是引物设计。由于真核生物核糖体DNA（rDNA）的不同基因和区段（18 S、28 S、5.8 S、ITS）具有高度保守性，常用于真菌菌属的鉴定[5-6]。笔者依据Genbank提供的假丝酵母18S基因保守序列，采用LAMP在线引物设计软件设计针对假丝酵母属的外引物F3、B3和内引物FIP、BIP等4种特异性引物，经过本实验6种常见假丝酵母菌均能呈现LAMP特异性扩增，而其他细菌如金黄色葡萄球群、肺炎双球群、铜绿假单胞菌、大肠杆菌及3种非假丝酵母菌属的真菌（新型隐球菌、毛霉菌）及人全血DNA样本均未见LAMP特异扩增。

LAMP反应体系中温度、BstDNA聚合酶、Mg2+浓度、扩增时间等，对扩增都有重要影响：温度通过影响反应体系酶的活性来影响扩增效率，笔者根据4种引物的退火温度范围，设计了涵盖56～77℃范围内8个温度在C1000梯度PCR扩增仪上进行温度梯度实验。结果显示，反应在退火温度高于70℃时扩增产量低，在退火温度为63~65℃时扩增产物量最大。由于Bst酶的最佳活性温度范围为60～65℃，温度过高或相对过低都可能影响链置换酶活性使扩增产量下降，所以最适温度应以63～65℃为宜。酶活性的高低可决定反应时间和扩增产物量。Mg2+以dNTP-Mg形式参与核酸骨架相互作用，并且可在一定程度上影响Bst酶的活性，两者常常相互作用。实验中根据Bst酶、Mg2+浓度对扩增效率的影响分别设计8IU、4IU和2、4和6mmol/L的浓度梯度，当Bst酶浓度减半至4IU后与Bst酶8IU的扩增效果差异无统计学意义，Mg2+浓度设置为4mmol/L时，LAMP扩增效率最高。考虑到Bst酶成本，选用Bst酶4IU、Mg2+4mmol/L为反应体系适宜浓度。时间对反应产物量有较大影响。本实验中设置的4个时间梯度内，扩增显示在30和45min已有较明显的扩增产物出现，60和90min2个时间段内LAMP均出现较强荧光，为了缩短检测时间，确定适宜扩增时间为60min。

由于4种LAMP引物是针对靶序列6个区域设计的，在6个区域中任何区域与引物不匹配时均不能进行核酸扩增，本实验显示假丝酵母菌各菌种均能进行特异的LAMP反应，敏感性达到102CFU/ml，与国内文献略有差异[7]，为PCR的10倍。

通过对52份临床样品的培养和LAMP检测证实，除6种实验假丝酵母菌菌种外，产朊假丝酵母、清酒假丝酵母、马铃薯假丝酵母等3种少见的假丝酵母菌菌种也能检出，而临床标本中，除7种对照菌种外，其他细菌对检测干扰很小（仅1例真菌有扩增，与假丝酵母菌基因同源性高），LAMP方法在阳性率、敏感性明显优于培养法。

与其他核酸扩增技术相比，LAMP技术特异、敏感，仪器设备要求低，操作简单，肉眼可直接观察，更适合基层医疗机构开展[8-9]。但由于敏感性高，防污染极为关键，否则，可能出现假阳性[6]。其不足之处是只能鉴定到假丝酵母菌菌属，但已可及时指导临床对患者的针对性治疗。LAMP技术的应用和推广，为进一步临床研究和临床早期确诊真菌感染和降低患者死亡率、提高患者预后提供了新的检测手段。

[1]张文,柏彩英,周强,等.血培养真菌的菌种分布及耐药性分析[J].国际检验医学杂志,2012,33(15):1889-1990.

[2]孔丹莉,周浩,王茜,等.环介导等温扩增技术快速检测血液中白色念珠菌[J].广东医学院学报,2011,29(6):600-601.

[3]廖万清,陈敏.侵袭性真菌病的诊断:现状与展望[J].菌物学报,2011,30(1):5-11.

[4]张宇,郭良栋.真菌DNA条形码研究进展[J].菌物学报,2012,31(6):809-820.

[5]周均亮,赵瑞琳.真菌DNA条形码技术研究进展[J].微生物学通报,2013,40(8):1468-1477.

[6]鲁勇,王一萍,应建飞,等.环介导等温扩增快速检测临床假丝酵母菌属方法建立与应用[J].中华医院感染学杂志,2015,25(6): 1204-1206.

[7]GHOSH R,NAGAVARDHINI A,SENGUPTA A,et al.Development of loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for rapid detection of Fusarium oxysporum,f.sp.ciceris,-wilt pathogen of chickpea[J].Bmc Research Notes,2015,8(1):1-10.

[8]路超,王长印,董振芳,等.环介导等温扩增技术的应用[J].分子诊断与治疗杂志,2011,3(2):138-144.

[9]DUAN Y B,GE C Y,ZHANG X K,et al.Development and evaluation of a novel and rapid detection assay for Botrytis cinerea based on loop-mediated isothermal amplification[J].Plos One,2014,9(10):e111094.

（张蕾编辑）

Establishment of loop-mediated isothermal am p lification forrapid detection of candida spp*

Jiang Lin,Xian-yongWen,Yan Lin,Zheng-hua Deng,Yuan-shuaiHuang
(Department of Laboratory Medicine,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo establish a rapid detection of candida spp on the basis of loop-mediated isothermal method.MethodsAccording to the gene bank,18 S rDNA gene sequence was provided.Primer Explorer V4 online design software design for the Candida genus-specific primers was used,and LAMP expansion method and the reaction system was set up.Four key parameters for the system and three performance were optimized and discussed, and then verified by clinical samples.ResultsSix kinds of candida were all positive,and the optimum temperature was 63℃-65℃,the activity of Bstwas 4 u,concentration of Mg2+was 4 mM,time was 1 h.All 7 kinds of clinical reference strains and Human whole blood DNA samples amplification results were negative.The detection limitwas 107-102 CFU/ml.A total of 52 cases of clinical samples proved that the method sensitivity was 100%,and the specificity was 95%.ConclusionsThemethod of the genus candida established by LAMP technology is significantly practical,simple,rapid,specific and sensitive.

candida;loop-mediated isothermal amplification;detectionmethods

R-331

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.002

1005-8982（2016）24-0006-05

2016-06-21

西南医科大学青年科技基金（No：2014QN-102）