氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达对动静脉内瘘患者血栓形成的影响

姚律，郝丽，郭长策，丁士新

（1.安徽医科大学第二附属医院肾内科，安徽合肥230601；2.海军安庆医院肾内科，安徽安庆246003）

氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达对动静脉内瘘患者血栓形成的影响

姚律1，郝丽1，郭长策2，丁士新2

（1.安徽医科大学第二附属医院肾内科，安徽合肥230601；2.海军安庆医院肾内科，安徽安庆246003）

目的探讨氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达对动静脉内瘘（AVF）患者血栓形成的影响。方法该院血液中心于2014年1月-2016年1月收治120例行AVF手术或AVF修补术的肾脏疾病患者依据AVF术后是否有血栓形成分为两组：A组71例（AVF术后有血栓形成），B组49例（AVF术后无血栓形成），比较两组患者氧化应激酶及信号通路蛋白水平。结果A组血浆甲状旁腺激素、半胱氨酸水平高于B组（P=0.000和0.000），血红蛋白、C反应蛋白水平低于B组，差异有统计学意义（P=0.000和0.000）；A组患者血管组织中超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、超氧化物歧化酶-2（SOD-2）、血红素氧化酶-1（HO-1）、Ras相关C3肉毒素酶解-2（Rac-2）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX-4）水平高于B组，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000和0.000）；A组患者血管组织中NADPH氧化酶亚单位P-22、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、叉头框蛋白01（P-Fox01）和叉头框蛋白03a（P-Fox03a）水平高于B组，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000和0.000）；内瘘患者血栓形成与血管组织中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平呈正相关（P=0.040、0.010、0.041、0.022、0.030、0.021、0.031、0.020和0.021）。结论氧化应激反应通过P13K/Fox0信号通路传导表达相关酶及蛋白，引发血管内皮损伤，导致动静脉内瘘吻合处狭窄及血栓形成，临床可通过干预动静脉内瘘患者体内应激反应及相关信号通路蛋白表达预防或治疗动静脉内瘘血栓的形成。

氧化应激；信号通路蛋白；动静脉内瘘；血栓

自体动静脉内瘘（arteriovenous fistula，AVF）具有创伤小、使用时间长、对心功能影响小、感染率低、安全性好等优点，已成为慢性肾衰竭患者维持性血液透析建立血管通路的主要方式[1]。然而，受多种因素影响，内瘘使用期间常发生阻塞，阻塞率高达30%~ 40%[2]，对患者生命产生严重威胁。研究表明，血栓是导致AVF障碍的主要原因之一[3]。尽管AVF血栓发生率较高，但其使用寿命长、费用低，因而在临床中仍广泛使用。因此，研究AVF血栓形成并进行防治具有重要意义。据报道[4]，氧化应激与血管内膜损伤及血管炎症相关，在介导动脉粥样硬化和血栓形成起始和进展中具有积极作用，而AVF患者长期处于高氧化应激水平，但这种长期的持续高氧化应激水平是否对AVF患者血栓形成产生影响，目前文献报道较少。本研究比较AVF有和无血栓生成患者氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达水平，分析AVF血栓生成与氧化应激的相关性，旨在探讨氧化应激在AVF患者血栓形成中的作用及机制，为临床预防和治疗AVF患者血栓形成提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月-2016年1月于安徽医科大学第二附属医院血液中心收治的120例行AVF手术或AVF修补术的肾脏疾病患者。男性76例，女性44例；年龄30～75岁；病程3个月～60个月；透析时间0.12～192个月；内瘘使用时间0.23～187个月。依据患者AVF术后是否形成血栓将患者分为两组：A组71例，内瘘成形术后有血栓形成；B组49例，内瘘成形术后无血栓形成。两组患者基线资料（见表1）差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。患者及其家属签署知情同意书，并获得本院伦理委员会批准。

表1 两组患者基线资料比较

纳入标准：①纳入符合《慢性肾脏病及透析的临床实践指南》（美国NKF-K/DOQI工作组2002年制定）[5]中慢性肾脏病诊断标准患者。②纳入符合内瘘血栓形成诊断标准[6]患者，具体诊断标准如下：内瘘杂音降低，透析血流量<180ml/min；内瘘杂音完全消失；B超或超声波检查确诊有内瘘血栓生成；患者局部疼痛，瘘口有血栓状硬物或触压疼痛；血管造影时血管明显狭窄，或无造影剂通过。③纳入符合中华人民共和国卫生部于2010年发布的《血液净化标准操作规程》[7]中自体AVF适应证患者。④纳入自愿参与并研究患者。排除标准：①合并神经性疾病、神志不清或语言失常患者。②合并肝、脑、肺部疾病患者。③符合《血液净化标准操作规程》中自体AVF禁忌证患者。④合并急性心脏衰竭、脑卒中、严重心律失常患者。⑤合并急性感染、肿瘤、肝硬化失代偿期患者。⑥哺乳期或妊娠期妇女。⑦使用人工合成移植血管通路患者。

1.2 研究方案

所有患者入院后记录临床资料，主要包括性别、年龄、原发病型、血浆白蛋白（ALB）、胆固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）、磷（P）、钙（Ca）、胱抑素C水平。入院后次日取空腹肘静脉血，离心测定血浆生化指标水平。

所有患者入院后行AVF成形术或AVF修补术，所有手术由同一位手术者完成，手术具体操作如下：内瘘吻合方式为头静脉-桡动脉端侧吻合，穿刺方式为绳梯式，内瘘首次使用为术后6～8周，透析血流量>200ml/min。透析液为碳酸氢盐，透析速率500ml/min，频率2～3次/周，每次4 h。透析结束后弹力腕带压迫止血。所有患者在AVF手术及AVF修补术时取静脉段标本，用于血管组织氧化应激相关酶及信号通路蛋白测定。

1.3 血浆生化指标及氧化应激相关酶、信号通路蛋白测定方法

血浆生化指标水平测定采用日立7600-010型全自动生化分析仪（日本Toshiba公司），主要包括血红蛋白（Hb）、甲状旁腺激素（iPTH）、C反应蛋白（CRP）和半胱氨酸水平。

氧化应激相关酶、信号通路蛋白测定采用蛋白免疫印迹法（Western blot）[8]，主要检测超氧化物歧化酶-1（superoxide dismutas-1，SOD-1）、超氧化物歧化酶-2（superoxide dismutas-2，SOD-2）、血红素氧化酶-1（hemeoxygenase，HO-1）、Ras相关C3肉毒素酶解-2（ras-Related C3 botulinum toxin substrate，Rac-2）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase-4，NOX-4）等酶蛋白和相关信号通路蛋白氧化酶亚单位p-22、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、叉头框蛋白01（forkhead box protein 01，P-Fox01）和叉头框蛋白03a（forkhead box protein 03a，P-Fox03a）表达水平。Western blot具体操作如下：取患者在AVF手术及AVF修补术时留下的静脉段标本，与Tris-HCl蛋白质缓冲液一起匀浆，4℃、1 500 r/min离心10min，取上清液测定总蛋白浓度，方法为比色法。取20mg上述上清液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，90 V电压下转移至硝酸纤维素膜2 h，在脱脂牛奶中加入第一抗体孵育15 h，缓冲液冲洗3次，加入过氧化物酶标记的驴抗兔IgG抗体，孵育1 h，缓冲液冲洗3次。增强发光并曝光，采用缓冲液冲洗3次，扫描蛋白条带的吸光度，并采用Quantity one软件分析蛋白吸光度，计算目的蛋白相对含量（为目的蛋白条带吸光度和β-actin条带吸光度百分比）。将B组相对蛋白含量计为100%，A组含量为A、B两组相对蛋白含量百分比。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料用χ2检验，t检验比较计量资料，AVF血栓形成与氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达的相关性分析采用Kendall等级相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血液生化指标比较

A组血浆iPTH、半胱氨酸水平高于B组（P= 0.000和0.000），Hb、CRP水平低于B组，差异有统计学意义（P=0.000和0.000）。见表2。

2.2 两组患者氧化应激相关酶水平比较

A、B两组患者氧化应激相关酶Western blot结果见图1，其定量分析结果见表3。A组患者血管组织中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2和NOX-4水平高于B组，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000和0.000）。

2.3 两组患者氧化应激信号通路蛋白水平比较

A、B两组患者氧化应激信号通路Western blot结果见图2，其定量分析结果见表4。A组患者血管组织中P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平高于B组，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000和0.000）。

表2 两组患者血液生化指标比较（±s）

表2 两组患者血液生化指标比较（±s）

半胱氨酸/（m m o l / L）A组（n= 7 1）7 3 . 1 ± 7 . 1 3 1 4 . 3 ± 2 0 . 1 9 . 4 ± 4 . 1 2 4 . 6 ± 6 . 5 B组（n= 4 9）1 1 0 . 4 ± 8 . 2 1 8 6 . 4 ± 1 3 . 2 3 6 . 3 ± 1 0 . 7 1 2 . 1 ± 5 . 1t值2 6 . 5 4 2 4 2 . 0 6 2 1 6 . 7 6 9 1 1 . 2 7 3P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0组别H b /（m m o l / L）i P T H /（p g / m l）C R P /（m g / m l）

图1 两组患者氧化应激相关酶Western blot实验结果

表3 两组患者氧化应激相关酶水平比较（%±s）

表3 两组患者氧化应激相关酶水平比较（%±s）

组别SOD-1 SOD-2 HO-1 Rac-2 NOX-4 A组（n=71）328.1±70.8 635.3±70.9 237.5±61.2 426.3±46.1 312.5±59.3 B组（n=49）100.0±11.1 100.0±17.2 100.0±9.8 100.0±8.5 100.0±19.7t值26.676 61.067 18.589 58.224 28.036P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图2 两组患者氧化应激相关信号通路Western blot实验结果

表4 两组患者氧化应激信号通路蛋白水平比较（%±s）

表4 两组患者氧化应激信号通路蛋白水平比较（%±s）

组别P-22 P13K P-Fox01 P-Fox03a A组（n=71）728.1±73.8 335.3±72.1 517.5±41.7 376.3±76.3 B组（n=49）100.0±8.2 100.0±7.0 100.0±7.8 100.0±8.9t值71.081 27.313 82.302 30.217P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 内瘘患者血栓形成与氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达相关性分析

内瘘患者血栓形成与血管组织中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和PFox03a水平呈正相关（P=0.040、0.010、0.041、0.022、0.030、0.021、0.031、0.020和0.021）。见表5。

表5 内瘘患者血栓形成与氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达相关性分析

3 讨论

内瘘血栓是AVF患者最常见的难题，也是导致患者2次住院的首要原因。对于肾脏疾病医生来说，预防并治疗内瘘血栓生成是血液透析患者治疗过程中最艰巨的课题之一[9]。据报道[10]，内瘘血栓形成是导致AVF狭窄甚至闭塞的重要原因。目前，大量研究人员对内瘘血栓形成原因进行深入研究，李彩凤等[11]认为糖尿病、CRP是内瘘血栓形成的危险因素，钟武华等[12]认为肾衰竭患者透析时血压过低、不适当穿刺及过度超滤导致内瘘血栓形成。其中，氧化应激与内瘘血栓形成的相关性已成为研究热点[13]。AVF患者长期处于高氧化应激水平，本文主要探讨氧化应激对内瘘血栓形成的影响，为内瘘血栓的预防和治疗提供依据。

AVF患者长期处于高氧化应激水平，而氧化应激是导致患者发生心血管并发症的重要原因[14]。本研究发现，AVF血栓形成患者体内氧化应激相关酶及信号通路蛋白表达高于无血栓形成患者，且内瘘患者血栓形成与血管组织中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平呈正相关，说明内瘘患者高氧化应激水平是导致内瘘血栓形成的重要原因，临床可通过下调内瘘患者氧化应激水平来预防或治疗血栓的形成。

氧化应激对AVF血栓形成的影响是一个复杂的过程。LIN等[15]研究发现，HO-1基因中有长GT序列重复基因多态性的血液透析患者AVF障碍发生率更高，提示氧化应激影响AVF血管内膜增生，导致内瘘狭窄或失效。血管内膜增生部位的平滑肌细胞、成纤维细胞是患者氧化应激所引起，氧化应激作用通过这些细胞参与血管内膜增生，并引发血管内皮功能紊乱。而血管内皮功能紊乱引起血管内膜损伤启动血栓形成：血管内皮功能紊乱导致血管张力调节作用减弱，血流速度降低，进而出现血小板附着、炎症和吞噬细菌侵蚀现象，激活凝血和纤溶系统，从而导致血栓生成[16]。据报道，P13K/Fox0通路[17]是氧化应激参与血管内皮功能的主要通道。P13K/Fox0通路受体及其蛋白主要包括Rac-2、SOD、HO-1和NOX4等。其中，Rac-2是通过血浆调控NADPH氧化酶活性来调节ROS生成的重要酶类之一，本研究发现，Rac-2是在AVF血栓患者中高表达，表明Rac-2可通过激活血管纤维生成和细胞收缩调节血管内皮细胞迁移，导致血管狭窄[18]。SOD和HO-1是血管损伤的保护因子[19]，在血管内皮功能紊乱调节中具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。本组中，内瘘血栓生成患者体内SOD和HO-1表达显著升高，说明在各种刺激下，防御性SOD和HO-1表达水平增加，起到保护血管、抑制血栓生成的作用。NOX4氧化酶在血管损伤中作用目前存在分歧[20]，但其在血管狭窄、高血压等疾病中高表达，本组中内瘘血栓患者中NOX4高表达，提示NOX4参与内瘘血栓形成，但具体机制有待于进一步研究。

综上所述，氧化应激酶及信号通路蛋白在维持性血液透析患者AVF血栓形成中扮演重要角色，有血栓形成患者氧化应激水平高于无血栓形成患者。氧化应激反应通过P13K/Fox0信号通路传导表达相关酶及蛋白，引发血管内皮损伤，促进AVF吻合处狭窄及血栓形成。因此，临床可通过干预AVF患者体内应激反应及相关信号通路蛋白表达预防或治疗AVF血栓的形成，为临床AVF患者血栓生成的预防和治疗提供了一种新的干预方案。

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（张蕾编辑）

Influence of oxidative stress-related enzymes and signal pathway protein expression on thrombosis in patientsw ith arteriovenous fistula

Lv Yao1,Li Hao1,Chang-ce Guo2,Shi-xin Ding2
(1.Department of internalmedicine,the Second Affiliated Hospital of Medical University of Anhui, Hefei,Anhui230601,China;2.Department of internalmedicine,Anqing Navy Hospital, Anqing,Anhui 246003,China)

ObjectiveTo investigate the influence of oxidative stress-related enzymes and signal pathway protein expression on arteriovenous fistula(AVF)in patientswith thrombosis.MethodsFrom January 2014 to January 2016, 120 patients treated with routine arteriovenous fistula(AVF)or AVF repair surgery were divided into two groups according whether AVF thrombosis occurred after surgery:A group of 71 cases(AVF thrombosis after surgery), group B had 49 cases(AVF postoperative thrombosis).Levels of blood biochemicalmarker,oxidative stress-related enzymes(SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2 and NOX-4)and related signaling pathway proteins(P-22,P13K,PFox01 and P-Fox03a)were compared.ResultsLevels ofplasma parathyroid hormone,homocysteine in group Awere significantly higher than group B(P=0.000,0.000),and hemoglobin,C-reactive protein levels were significantlylower than group B,the differenceswere significant(P=0.000,0.000).Levels of SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2 and NOX-4 in group A were significantly higher than group B,the differences were statistically significant(P=0.000, 0.000,0.000,0.000,0.000).Levels of P-22,P13K,P-Fox01 and P-Fox03a in vastular tissue of group A were higher than group B,the differences were significant(P=0.000,0.000,0.000,0.000).Fistula thrombosis in patients with vascular tissuewere significantly correlated with SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2,NOX-4,P-22,P13K,P-Fox01 and P-Fox03a levels(P=0.040,0.010,0.041,0.022,0.030,0.021,0.031,0.020,0.021).ConclusionsThe oxidative stress expresses protein associated enzymes by P13K/Fox0 signal transduction pathway,causes endothelial damage, leads to stenosis of arteriovenous fistula and anastomosis thrombosis.Clinical intervention by the stress response can move fistula patients intravenously and in vivo signaling pathway associated protein expression in the formation of prevention or treatmentof arteriovenous fistula thrombosis.

oxidative stress;signal pathway protein;arteriovenous fistula;thrombus

R 543

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.006

1005-8982（2016）24-0028-05

2016-05-17

郝丽，E-mail：haoliqilin@163.com