自噬在急性脑损伤的研究进展

刘雪 王枫 熊利泽

(第四军医大学西京医院麻醉及围术期医学科，陕西 西安 710032)

·综述·

自噬在急性脑损伤的研究进展

刘雪 王枫 熊利泽*

(第四军医大学西京医院麻醉及围术期医学科，陕西 西安 710032)

自噬; 急性脑损伤; 自噬诱导; 自噬抑制; 神经保护; 神经毒性

半个世纪以前，比利时细胞学家Christian de Duve用自噬这一术语来描述细胞利用溶酶体来消化胞浆成分这一过程。依据待降解产物运送到溶酶体时的形态不同，自噬主要可以分为三类：①大自噬，其特征是形成独特的双层膜细胞器-自噬小体，这是一种通过自噬小体与溶酶体融合的途径并在细胞稳态中起着重要作用；②小自噬，溶酶体器膜将胞浆成分直接内吞进去；③分子伴侣介导的自噬，是由分子伴侣热休克蛋白70、溶酶体相关的膜蛋白2A介导的降解过程[1]。而本文主要探讨的是大自噬(以下称之为自噬)。一般情况下，自噬保持在基线水平并维持亚细胞结构的功能，如内质网和线粒体。在没有外部刺激的情况下，中枢神经系统中正常的自噬功能对于维持神经元的存活是必须的，另外，自噬通过监测影响稳态的一系列指标来应对环境中的刺激。因此，细胞可以调整自噬流，即，进行着的自噬反应协同溶酶体降解来应对胞内或胞外微环境的变动，适应性自噬经常介导显著的细胞保护作用和抗炎效应[2]。因此，自噬的缺陷会导致多种细胞稳态丧失和随后细胞死亡的人体病理学，这些病理过程包括心血管和肾脏疾病。另外，自噬缺陷会削弱抗炎反应稳态并增加宿主对感染性疾病的易感性，并且越来越多的证据表明功能性的自噬反应至少在一些情况下参与了一种特殊类型的细胞死亡方式，称为可调控的细胞死亡(regulated cell death, RCD)，又称为自噬性死亡[3]。这一证据说明了自噬在某些特定环境下调控细胞毒性作用而不是细胞保护作用。在这篇综述中，我们讨论了近期的发现表明在不同类型的非感染性急性脑损伤中自噬发挥环境特异性影响，包括兴奋性毒性改变、神经毒性、新生儿窒息、成人脑卒中和神经创伤，着重强调使用自噬的药物调控(激动剂或抑制剂)发挥的神经保护作用。

一、自噬总体的调控

自噬取决于自噬相关蛋白家族的多种成员，协同作用介导自噬的启动、囊泡成核、囊泡的扩展以及囊泡融合、自噬小体的降解退化[4]。自噬相关基因(autophagy related gene, ATG) 9是介导自噬小体形成中的一个重要的蛋白，ATG3、ATG4和ATG7共同催化微管相关的蛋白1轻链3 (microtubule-associated membrane protein 1 light chain 3 B, MAP1LC3B)的脂化，而这一蛋白随后积累在自噬小体膜上并结合待降解产物以便进行自噬性降解。另外，ATG7与ATG10共同促进ATG5-ATG12-ATG16L1 (autophagy related gene 16-like 1)复合物的形成，这一过程有助于自噬小体的延伸[5]。在众多信号转导通路中影响自噬激活状态的有两个多蛋白复合物：雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1, MTORC1)或超大分子复杂混合物(beclin1, BECN1)和3型磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic type 3, PI3KC3/VPS34)。MTORC1包含雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, MTOR)和MTOR调控相关蛋白，作为自噬的主要抑制剂，与此相反，BECN1-VPS34复合物通过催化磷脂酰肌醇3磷酸化而促进自噬进程[4]。在在体和离体实验中一些代谢的、物理的和化学的诱因可以促进自噬形态学和生物化学特征的表现，包括多种自噬相关蛋白的表达上调，如ATG5、ATG7，以及Sequestosome1(p62)的降解，胞质内自噬小体和自噬溶酶体(胞质液泡化)的累积，以及自噬相关蛋白8(microtubule-associated membrane protein 1 light chain 3, LC3)的脂化[2]。然而，胞质液泡化和LC3脂化反映了自噬容量的增加，意味着当自噬小体与溶酶体无法融合或溶酶体功能受阻时自噬小体的数量仍是增加的，因此监测自噬流对于理解其正在进行或者是自噬被阻断变得至关重要。当神经毒性伴随着自噬流阻断，加快自噬清除或抑制自噬小体的形成或许能介导神经保护作用，而此时药物促进自噬小体的形成或抑制溶酶体降解则发挥毒害作用。

二、自噬在急性脑损伤中的作用

1.自噬在兴奋性毒性中的作用：兴奋性毒性指的是突触后膜延长的去极化导致持续的钙离子内流。兴奋性毒性物质如谷氨酸、喹啉酸、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)和红藻氨酸等被报道在啮齿类动物中能诱导自噬反应上调。然而，自噬是否保护神经元免受兴奋性毒性损伤还不明确。证据(特别是离体实验)表明自噬或许能减轻兴奋毒性的有害影响，自噬的药物激活剂，包括雷帕霉素和海藻糖保护新生大鼠海马神经元在离体实验中由谷氨酸介导的兴奋毒性死亡，而氯喹(自噬抑制剂)在这种环境下没有有益的影响[6]。丙酮酸盐(刺激VPS34激活和保存适宜的生物能量)减少谷氨酸应用于人类成神经细胞瘤细胞系所产生的神经毒性，而这种效应可以被非特异性VPS34抑制剂3-甲基腺嘌呤阻断。锂(刺激自噬)通过产生海藻酸来抑制兴奋性毒性物质对鸡或小鼠胚胎脊柱运动神经元的损害。另外，BECN1或高迁移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1)的敲除则增加了培养的大鼠神经元对NMDA的敏感性[7]。这些结果说明至少在某些情况下，谷氨酸或其它兴奋毒性物质或许能通过造成线粒体功能紊乱和因此带来的氧化压力而阻断自噬反应，在这种情况下上调自噬发挥神经保护作用。

2.自噬在急性神经毒性反应中的作用：急性神经毒性指的是暴露于神经毒素几个小时到几天。鱼藤酮为一种神经毒性物质，在实验环境下抑制线粒体呼吸链一型复合物，在大鼠和小鼠上建立一种帕金森疾病样状态。神经元细胞系急性暴露于鱼藤酮导致快速的RCD以及自噬现象。自噬的药物激活剂包括雷帕霉素、去铁胺(铁的螯合剂，激活自噬)、山奈酚[一种植物雌激素，可以激活AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)]减少了鱼藤酮对神经元细胞系的神经毒性效应。当黑质多巴胺能神经元细胞系暴露于鱼藤酮，敲除高度特异的亮氨酸传感器(sestrin2, SESN2)(MTORC1抑制剂的上游因子)，削弱了自噬反应并加重了神经毒性作用，然而SESN2的过表达则激活了AMPK依赖的自噬反应，同时抑制了RCD[8]。使用小干扰RNA特异性下调3-磷酸甘油醛脱氢酶，这种酶能够发挥自噬调控功能，在大鼠心肌细胞的实验上得出了类似的结果[9]。敲除人类神经元细胞系中BECN1或LC3则增加其对奥氮平的敏感性，在氯喹出现的情况下小鼠对奥氮平的敏感性同样也是增加的[10]。总之，以上这些现象倾向于支持自噬反应限制急性神经毒性损伤作用。

3.自噬在新生儿窒息中的作用：新生儿死于缺血缺氧性脑病在多个大脑区域中表现出结构和生化上自噬水平上调，这些区域包括神经节、丘脑、皮层和海马。这些自噬的标记包括胞质的液泡化、BECN1上调、LC3脂化和p62降解[11]。一般来说，啮齿类动物神经元在新生儿窒息模型中表现出自噬上调、RCD和进行着的细胞降解。这些特征包括轴突或突触的肿胀，线粒体碎片化，染色质碎片化或固缩以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)激活等。第一个研究新生大鼠缺血缺氧模型的实验观察了在缺血后给予雷帕霉素可以减少模型带来的损伤[12]。同时这种神经保护作用可以被随后应用的3-甲基腺嘌呤阻断[13]，证明这种保护效应来自于自噬反应。然而，尽管缺血后给予3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素改变了神经元死亡的分子机制(从caspase 3-依赖的凋亡到坏死)，并没有一种自噬抑制剂能真正地减轻新生大鼠在缺血缺氧中的损伤[12]。与此有争议的结论是，锂(激活自噬)在大鼠新生儿缺血缺氧模型中发挥神经保护作用，但却降低了LC3脂化，这一现象同自噬抑制相一致，而不是激活。另外，其它几个独立的团队得出以下结果，3-甲基腺嘌呤降低原代大鼠皮层神经元、大鼠海马切片以及人类神经元细胞系暴露于氧糖剥夺状态下的细胞死亡[14]。类似的，新生大鼠在缺血后(缺血后4 h)在侧脑室给予3-甲基腺嘌呤相比对照组明显减少了病损面积[15]。总结起来，这些数据对于自噬在新生儿缺血缺氧中的作用并未得出一致结论。

4.自噬在成人脑卒中中的作用：成年小鼠或大鼠在给予缺血损伤后表现出自噬水平上调的特征。至少有两条证据表明自噬在成年啮齿类动物暴露于缺血事件中如短暂的大脑中动脉缺血(transient middle cerebral occlusion, tMCAO; 通常是缺血30 min到3 h)或永久的大脑中动脉缺血(permanent middle cerebral occlusion, pMCAO)发挥保护作用。首先，使用基因水平的干涉手段抑制自噬水平，包括敲除线粒体超氧化物歧化酶2、S-抗原、视网膜和松果体(抑制蛋白)，或者是使用靶向编码结节性硬化症蛋白1-基因的shRNA[16]，加重了神经元在tMCAO或pMCAO中的损伤。使用立体定位技术过表达尼克酰胺磷酸核糖转移酶，上调自噬水平，在成年大鼠遭受tMCAO损伤时发挥了显著的神经保护作用。另外，抑制自噬水平，如敲除蛋白激酶AMP-激活的α2催化亚基或去乙酰化酶1，或下调ATG7或结节性硬化症蛋白1则加重了原代大鼠或小鼠皮层神经元暴露于氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)下的神经毒性。使用干扰RNA技术介导溶酶体相关的膜蛋白2(介导分子伴侣介导的自噬)而不是ATG5(特异性参与大自噬)，增加了小鼠来源的神经瘤母细胞(mouse neuroblastoma N2a cells, Neuro-2a)细胞对单独缺氧的易感性，然而使用麦考酚酸激活分子伴侣介导的自噬则会带来显著的神经保护作用[17]。这些发现证明了不同形式的自噬类型在不同情况下缺血损伤的中发挥不同的作用。使用自噬诱导剂雷帕霉素在小鼠tMCAO或pMCAO模型中减少了脑梗面积；然而，类似的结果却在使用了自噬抑制剂氯喹(尽管神经保护作用比较轻微)上得出。另外，尽管3-甲基腺嘌呤或mdivi-1(线粒体自噬的抑制剂)加重了小鼠神经元在tMCAO中的丧失，然而在pMCAO模型中却表现出了神经保护作用或无作用[18]。近期的研究成果对自噬在成人脑卒中模型中总是发挥神经保护作用提出质疑。因此，总结以上结果，我们对自噬在成人脑卒中介导的神经保护或神经毒性损伤作用并不能得出一致结论。

5.自噬在神经创伤中的作用：自噬在几种不同类型中的神经创伤中都有研究，包括脊柱损伤，蛛网膜下腔出血和创伤性脑损害，其自噬的形态学和生化指标明显上调，无论在啮齿类动物还是在人类活体组织切片上。只有两个研究试图阐明这些生化指标反映的是自噬本身水平的上调还是由于自噬被阻断，这两项研究均倾向于后者。大量的实验结果证明在神经创伤的动物模型中自噬发挥细胞保护作用，有助于功能恢复。针对病灶雷帕霉素促进神经元存活，促进轴突再生并促进啮齿类动物在脊柱损伤中的后肢功能[19]。类似的结果也在自噬激活措施中得到证明，包括脊柱损伤后给予人类血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A 165, VEGFA165)[20]，视黄酸(减少血-脊柱屏障破坏)和辛伐他汀(抗粥样硬化药物)。然而，VEGFA165或视黄酸的神经保护作用都能分别被3-甲基腺嘌呤或氯喹阻断。雷帕霉素限制了脊柱损伤并促进运动功能的恢复，即便是患有糖尿病的大鼠(其对神经病理损伤的敏感性高于野生型大鼠)。另外，3-甲基腺嘌呤或敲除BECN1都能加重原代脊柱神经元细胞在机械性损伤中的死亡率，然而BECN1的过表达或使用雷帕霉素则发挥神经保护作用[21]。使用自噬诱导剂雷帕霉素、褪黑激素、辛伐他汀、曲古菌素A或重组的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, CST3)都能减少大鼠在蛛网膜下腔出血中的大脑创伤[22]。在这种环境下，使用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素抑制自噬水平则加重蛛网膜下腔出血急行神经退行性疾病，或废除自噬激活带来的神经保护作用。总的来说自噬对抗由脊柱损伤和蛛网膜下腔出血导致的急性神经退行性疾病。

三、结语和展望

正如上述讨论，自噬在某些急性脑损伤中存在影响，包括多种精神药物中毒、脊柱损伤、蛛网膜下腔出血、新生儿缺血缺氧等等，然而，针对不同的急性脑损伤类型，包括兴奋性毒性、可卡因中毒、成人脑卒中和创伤性脑损害等自噬反应调控也存在差异。近20年在顶尖杂志上的文章得出的结果具有异质性同时是明显矛盾的。尽管这些结果部分差异性应归咎于实验因素的不同(包括模型类型、强度和神经毒性的耐受性)，但至少有四部分因素应该被考虑在内：①刺激的密度和强度或许能决定自噬在神经元暴露于急性压力(当神经毒性状态比较强并且被延长)时的死亡或产生显著的细胞保护作用和密封效应(当神经毒性状态比较弱或及时被限制)。②大多数的这些研究缺少检测精确的自噬流。③以上的研究中自噬大多被药物所调控，而这些药物所表现的特异性都不是很高(如3-甲基腺嘌呤或溶酶体抑制剂)，或者在基因水平上靶向自噬的某单一成分，而这些蛋白很可能参与到其他同自噬无关的通路中。④由急性脑损害产生的局部炎症反应所带来的长期功能损害至少部分是因为小胶质细胞应对垂死神经元释放的危险信号所启动的。因此这些自噬诱导剂或抑制剂所带来的效应可能来源于：自噬对释放的危险信号的影响；自噬对炎症的控制；或自噬的药物调控影响炎症反应作为一种非靶向效应。一个比较相关的例子是自噬抑制剂氯喹有明显的抗炎效应，同时这种抗炎效应可以用来治疗系统性红斑狼疮。总结全篇，以上这些结果强调急需使用一种更好的工具或方法检测在急性脑损伤中自噬的确切影响。

致谢：衷心感谢西京医院麻醉与围术期医学科王枫讲师对于撰写论文的帮助和支持！感谢对于课题的指导！

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1671-2897(2017)16-371-03

国家自然科学基金-国际合作与交流项目资助项目(81420108013)

刘雪，硕士研究生，E-mail: 15229059536@163.com

*通讯作者：熊利泽，教授，E-mail: mzkxlz@126.com

R 782.05+4

A

2016-11-20；

2017-03-05)