micro RNAs在急性胰腺炎中的研究新进展

贾重阳 张辰龙 张小强

·综述·

micro RNAs在急性胰腺炎中的研究新进展

贾重阳1张辰龙2张小强1

MicroRNAs(miRNAs)是属于小的非编码RNA(small non-coding RNA),长约19～23个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子[1-3],约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体且经过Dicer酶加工后生成。有5’端磷酸基和3’羟基,大小约21～25nt的小分子RNA片断,定位于RNA前体的3’端或者5’端。目前认为，miRNA是基因表达的主要调节分子,以序列互补的方式与特异靶mRNA结合,通过降解靶mRNA或者抑制其蛋白翻译调控靶基因的表达。miRNA不但在基本的生物过程,如发育、应激反应、代谢和基因组完整性维持等方面有基本而重要的调控作用,在疾病的发展全过程中,也发挥着重要的调控作用[4-6]。miRNAs不仅存在细胞内,最近的研究表明在血浆和血清中同样稳定存在着miRNAs[7],也同样稳定的存在于包括唾液[8]、尿液[9]、乳汁[10]、精浆、眼泪、羊水、支气管肺泡灌洗液、脑脊髓液、腹膜液和胸膜液[11-12]等各种体液中,且种类不同,其含量亦明显不同[13]。这些结果提示细胞外miRNAs可以作为疾病诊断的生物标志物,也揭示了细胞外miRNAs在人体中介导细胞间通讯方式。目前miRNAs在不同恶性肿瘤方面研究成果颇多,但对于急性胰腺炎(acute panreatitis,AP)的研究相对较少。笔者从现有文献中检索并予以归纳总结。

一、作为生物标记物

1.miRNA正常胰腺组织中的表达:Szafranska等[14]发现miR-216和miR-217表达与miR-133a的缺失表达可用于确定组织或细胞的胰腺来源。Erener等[15]分别测定了人群及C57BL/6小鼠的多种组织中miR-375的分布情况结果显示无论是在人群还是小鼠中miR-375在胰腺中都呈高表达状态。

2.miRNA在胰腺炎中的表达:王春全等[16]发现miR-216a在AP患者的外周血中的含量较健康人群和淀粉酶非特异性升高的人群均显著升高,该作者认为miR-216a可作为AP早期诊断的标志物之一。Usborne等[17]对胰腺外分泌损伤(exocrine pancreatic injury,EPIJ)的动物模型(采用蛙皮素或氰基羟基丁烷cyanohydroxybutene,CHB诱导)中生物标记物进行研究,发现微小EPIJ与血液或炎症生物标记变化无关。EPIJ严重程度评分的增加与淀粉酶和脂肪酶的增加相关,在24～48 h EPIJ是最严重的,在24 h mir-216a(32倍)和mir-375(23倍) 增加,在48 h时蛙皮素组的酶处于正常。在CHB 组mirs-216a和mir-375分别增加了800 和500倍,在24～72 h mir-375仍然升高。该作者认为对于EPIJ胰腺富集miRs有希望作为新型血清学标志物。

Liu等[18]采用队列和对照研究来阐明急性胰腺炎患者血清中miRNA的表达,采用miRNA芯片分析,发现在AP患者和对照组的血清中测出205个miRNAs差异性表达,9个miRNAs在严重和轻度AP患者的血清中是差异性表达的。进一步确认在AP患者中miR-92B、miR-10a和miR-7下调,采用受试者工作特征(ROC)分析法表明，在AP患者血清中这些miRNA可以与正常人区别。此外,血清中miR-551b-5p水平在具有并发症或低血钙AP患者中显著升高。ROC分析表明，血清miR-551b-5p水平可以区分AP的严重度和轻度。最终Liu等[18]认为，miR-92b,miR-10a,and miR-7的表达可用于AP患者的早期诊断,miR-551b-5p的表达可用于预测AP的严重程度。

Zhang等[19]采用L-精氨酸诱导的急性胰腺炎模型和非致死性大鼠盲肠结扎穿刺(CLP) 诱导的脓毒症动物模型研究了血清miR-216作为胰腺损伤标志的潜在重要性和特异性,结果在急性胰腺炎模型,精氨酸给药后24 h miR-216a浓度显著升高,而术后48 h miR-216a能显著增加。该作者首次提出血清中miR-216可能作为胰腺损伤的新颖的特异性候选标志物。Goodwin等[20]认为胰腺外分泌的轻度损伤往往是无症状的,可能会导致误诊。采用蛙皮素、L-精氨酸和胰管结扎法诱导啮齿动物产生胰腺外分泌损伤的AP动物模型,检测胰腺富集的miR-216a和miR-217,结果显示这两者对胰腺损伤反应呈时间-剂量关系,并且和血清淀粉酶或脂肪酶相比有较宽的动态范围,他们认为胰腺选择性microRNA在啮齿动物胰腺损伤中比当前使用的血清生物标志物有较高敏感性和更大的特异性。Endo等[21]发现miR-216a和216b主要表达在胰腺腺泡细胞中,miR-216a和miR-216b的血浆浓度在L-精氨酸诱导的AP模型大鼠中显著增加。因此,他们认为miRNA的表达谱作为细胞或组织特异性损伤的生物标志物是有用的。

Blenkiron等[22]从肠系膜淋巴结(mesenteric lymph,ML)和外周血中分离miRNA,并找出在AP中的变化。发现85个miRNAs在大鼠ML是可检测到,miR-375,-217,-148a,-216a,-122,-214,-138在AP大鼠的ML分别升高。在临床研究中,血浆miR-216a在轻度和中度AP中也显著增加的。因此，该作者也首次证明在淋巴循环中miRNA的存在以及在AP中特异性miRNA的改变,同时也认为miRNA可以作为AP的新颖的生物标志物来研究。

An等[23]研究高甘油三酯血症引起的急性胰腺炎(hypertriglyceridemia induced acute pancreatitis,HTAP)患者血清中miRNA的变化,并认为该变化可以作为非侵入性生物标记物来判断疾病的进展。该研究发现，在HTAP患者血清中miR24-3p,361-5p,1246和222-3p不断上调,181A-5p不断下调；生物信息学分析预测,重叠miRNA参与调节了13 个GOs和36个通路,涉及到葡萄糖、脂肪、钙离子和胰岛素等。miRNA-mRNA网络显示该重叠miRNA靶基因参与胰腺代谢,唯一下调的miR-181a-5p与甘油三酯、总胆固醇以及空腹血糖呈负相关,但与钙离子呈正相关。与炎性细胞因子相比,这五个重叠miRNA的变化更稳定。用于评价HTAP的进展时,miRNA表现出良好的曲线下面积(area under the curve,AUC)。这些数据表明血清miRNA具有成为优良HTAP生物标志物的潜力。

Azevedo等[24]对胰腺组织进行活检发现，在正常胰腺组织中没有凋亡的腺泡细胞而在AP组织中存在凋亡的腺泡细胞且与AP严重程度有一定相关性,采用miRNA芯片技术筛选出8种可能与AP腺泡细胞凋亡相关的miRNA:miR-19b,miR-15b,miR-363 miR-92b,miR-99b,miR-614,miR-22和miR-135a。

Kusnierz等[25]通过研究hsa-miR-16-5p,-103a-3p,-122-5p,-126-5p,-148a-5p,-216a-5p,-375和 -551b-5b应用与临床AP患者的严重程度分层。该研究组发现在SAP患者中,mir-126-5p,-148a-3p,-216a-5p，-216b-5p,mir-375与对照组相比显著增加。在中度胰腺炎患者中,内皮特定mir-216-5p,-551b-5p和mir-375明显升高,且mir-375在胰腺中表达非常丰富。ROC曲线显示mir-126-p和mir-551b-5p可以预测AP的严重程度。该作者认为胰腺miRNA信号可以用于评估AP急性期的胰腺损伤。AP期间的内皮功能紊乱反映在循环中miRNA的水平,也有助于患者病情的分层。

二、发病机制研究

Tian等[26]研究miRNA-155在实验性重症急性胰腺炎(severe acute panreatitis,SAP)中的异常表达,及是否调节肠道上皮细胞顶端连接复合体蛋白。结果显示，腹腔注射蛙皮素和脂多糖成功诱导实验性急性胰腺损伤和肠上皮屏障破坏。与对照组相比,SAP中血清淀粉酶水平和TNF-α显著升高。miR-155在SAP的肠上皮细胞过度表达,RhoA基因是miR-155靶基因之一,在三个主要未翻译区包含三个miR-155特异性结合位点。尽管RhoA mRNA表达在SAP中没有显著变化,但是RhoA和E-钙粘蛋白在SAP肠上皮是低表达；他们的结论是TNF-α调节的miR-155的过表达抑制了ZO-1的顶点联络复合体(apical junctional complex,AJC)成分蛋白质的合成,E-钙粘蛋白通过下调转录后的RhoA表达,并破坏实验SAP的肠上皮屏障。

Qin等[27]检测了急性水肿性胰腺炎(acute edematous pancreatitis,AEP)大鼠体内miR-22和mir-135a的表达和其目的基因。与对照组体内和体外动物模型相比较,AEP组中的miR-22和miR-135a的表达水平明显增加。在携带miRNA的慢病毒转录的AR42细胞中,miR-22和miR-135a的表达水平显著升高,而其靶基因的表达水平显著减少。TNF-α诱导的细胞凋亡率比非诱导的细胞要高得多。抗miRNA的寡核苷酸转录的AR42J细胞中miR-22和miR-135a低水平表达,并有较低的细胞凋亡率,但ErbB3和PtK2的表达水平明显增高。认为在AEP中miR-22和miR-135a的表达水平升高的,通过抑制ErbB3和PK2的表达,上调miR-22和miR-135a的表达可以促进胰腺腺泡细胞的凋亡。

Zhang等[28]为了探讨TGF-β和mir-216a如参与AP小鼠和大鼠胰腺腺泡AR42J细胞的发病机制,发现TGF-β抑制剂SB431542显著降低蛙皮素诱导的小鼠胰腺炎模型的血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、TGF-β1α、TGF-β含量,抑制了mir-216a的表达和胰腺组织病理学变化。TGF-β诱导AR42J细胞中的mir-216a。张力同源蛋白物和是TGF-βs超家族细胞因子被鉴定为mir-216a可能的靶标。在腺泡细胞AR42J中mir-216a过表达或者封闭的转染对PTEN(张力蛋白同源物)和Smad7(蛋白家族7,转化因子TGF-βs超家族重要的细胞因子)的表达起下调(或上调)作用,从而影响下游pAkt(磷酸化Akt(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)) 和TGF-β受体Ⅰ的表达,在小鼠模型和腺泡细胞AR42J中由mir-216a调节的 这些蛋白质表达的变化可以通过SB431542调节。结论认为TGF-β通过诱导miR-216a 作用于靶蛋白 PTEN 和Smad7而产生急性胰腺炎,因此,通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B和TGF-β反馈通路。

三、总结与展望

miRNAs在AP中的研究主要集中在该病的诊断和预后中,并建议在临床诊断中使用miRNAs作为生物标记物来协助明确诊断,仅有少部分文献关注miRNAs在AP发病机制方面的研究,对于AP的生物治疗药物目前尚存甚少。因此，希望有更多的研究人员关注生物标志物的同时,能从发病机制和生药药物开发方面积极探索,为临床诊断和治疗AP提供帮助,并开发安全、高效、低廉、方便可用的药物。

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730000 兰州市第二人民医院肝胆外科1;610041 成都四川,四川大学华西医院中西医结合科2

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2017-03-29)

(本文编辑:李建忠)