病理性钙信号与急性胰腺炎

牛梦亚 文礼

上海市胰腺疾病重点实验室，上海交通大学医学院附属第一人民医院消化科，上海 201600

【提要】 胰腺腺泡细胞异常钙信号是AP最早期的细胞内事件，在AP的发生和发展过程中起关键作用。腺泡细胞内钙信号的转导受细胞内钙信号元件严格调控，主要包括细胞内钙库上表达的钙释放通道如三磷酸肌醇受体和兰尼碱受体、细胞膜上的钙库操纵型钙内流通道以及参与回补胞内钙库的肌质网膜钙ATP酶和参与钙外排的胞膜钙ATP酶等。目前研究提示这些钙信号元件或可作为AP早期治疗的干预靶点。本文围绕钙库操纵型钙内流通道及钙信号下游效应分子开展了深入系统的研究，旨在探索靶向钙信号的新型AP早期治疗的药物靶点。

AP是消化系统的常见疾病之一，年发病率为4.9～73.4/10万，且呈逐年上升趋势，其中伴有全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能衰竭的SAP病死率高达30%，严重危及人民生命健康[1-2]。我国最常见的AP病因为胆石症和高脂血症，与ERCP或某些药物如天门冬酰胺酶等相关的AP亦受到研究者的关注[3]。上述这些AP病因均可引起胰腺腺泡细胞出现病理性钙信号，是AP发生的重要诱因。笔者所在课题组围绕钙信号与AP开展了系统性研究，本文拟概述细胞内病理性钙信号与AP发生和发展的研究进展，为靶向钙信号通路早期治疗AP的干预策略提供理论依据。

一、胰腺腺泡细胞钙超载是胰腺炎发生的重要诱因

胰腺外分泌功能单元是由胰腺腺泡细胞和胰腺导管上皮细胞共同组成。胰腺腺泡细胞合成并分泌多种消化酶和少量富含NaCl的液体；而胰腺导管上皮细胞则负责重吸收Cl-并分泌大量的HCO3-和H2O形成胰液。腺泡细胞生理性钙信号主要表现为局限于细胞顶部的振荡型钙信号，是胰腺正常分泌消化酶必不可少的；病理性钙信号主要表现为全细胞持续性、非钙振荡、钙峰-钙平台型(peak-plateau)钙信号，又被称为腺泡细胞“钙超载”。1995年英国利物浦大学Petersen和Sutton教授共同提出胰腺腺泡细胞钙超载是AP的重要诱因[4]。之后证实几乎所有与胰腺炎病因相关的刺激物均通过诱导腺泡细胞出现病理性钙信号，引起细胞内酶原激活、细胞空泡化、内质网过度应激、线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)增加、ATP合成下降、坏死通路激活等一系列AP相关的病理生理学改变[5]。Raraty等[6]发现高浓度的缩胆囊素(cholecystokinin，CCK)引起小鼠胰腺腺泡细胞出现典型的钙峰-钙平台型病理性钙信号，即一个大幅度的初始钙峰，伴随一个延长的钙平台期，这与腺泡细胞内胰蛋白酶原的活化密切相关，进一步研究发现去除细胞外液中的钙离子或使用钙离子螯合剂(1,2-bis(O-aminophenoxy)ethane-N,N,N9,N9-tetraacetic acid，BAPTA)可抑制腺泡细胞内胰蛋白酶原的活化。Murphy等[7]报道了人腺泡细胞对高浓度的CCK亦有类似的反应。然而，人胰腺腺泡细胞是否能有效地对CCK起反应仍存在争议[8]，且有研究提示CCK受体极少在人胰腺腺泡细胞表达[9]。胆源性胰腺炎是AP常见的病因之一。胆汁酸盐是胆汁主要成分，其包括牛磺石胆酸盐、牛磺胆酸盐和牛去氧胆酸盐等，病理情况下，胆汁酸随胆汁反流进入胰腺，成为与胆源性胰腺炎密切相关的刺激物。Voronina等[10]发现以牛磺胆酸钠(taurolithocholic acid 3-sulfate,TLCS)为主的多种天然胆酸盐均可剂量依赖性地引起腺泡细胞出现病理性钙信号，并由细胞顶部向基底部蔓延。Criddle等[11-12]报道乙醇的非氧化代谢物脂肪酸乙酯亦可引起腺泡细胞内病理性钙信号，并进一步揭示脂肪酸乙酯是通过三磷酸肌醇受体促进钙释放，水解后直接抑制线粒体ATP合成，导致主要参与钙外排的质膜钙ATP酶功能障碍，进而加重胰腺腺泡细胞钙超载。游离脂肪酸是高脂血症型AP的主要刺激物，同样可引起腺泡细胞持续性病理性钙信号相关的细胞损伤[13]。此外，Jin等[14]还发现ERCP所用的造影剂碘海醇或碘帕醇可引起人和小鼠胰腺腺泡细胞出现病理性钙信号，并通过激活NF-κB促炎信号通路和钙调神经磷酸酶活化T细胞核因子轴导致腺泡细胞坏死和AP。笔者所在课题组研究发现，即使在生理浓度卡巴胆碱的刺激下，短暂性胰管内压力升高即导致腺泡细胞出现典型的钙峰-钙平台型病理性钙信号，是胰管高压诱发胰腺炎的重要原因[15]。Peng等[16]发现用于儿童急性淋巴细胞白血病的标准化疗药天冬酰胺酶亦通过引起腺泡细胞钙超载并抑制ATP的合成，引起腺泡细胞坏死并诱发天冬酰胺酶相关的胰腺炎。上述研究均提示胰腺腺泡细胞钙超载是AP的重要诱因。近年来，胰腺导管上皮细胞在胰腺炎中的作用也逐渐受到关注。临床数据提示胰腺导管上皮细胞分泌功能障碍与AP的发生及严重程度呈正相关[17-18]。Hegyi团队的研究提示，高浓度胆酸盐、乙醇及其非氧化代谢物、脂肪酸等均可引起胰腺导管上皮细胞内钙超载，导致导管上皮细胞分泌功能障碍和细胞坏死[19-20]。

二、钙信号元件可作为AP早期治疗的潜在干预靶点

胰腺腺泡细胞内钙信号的转导严格受到钙信号元件的调控，这些钙信号元件在腺泡细胞上均表达，主要包括细胞内钙库上表达的钙释放通道如三磷酸肌醇受体(inositol triphosphate receptor，IP3Rs)和兰尼碱受体(ryanodine receptors，RyRs)、细胞膜上的钙库操纵型钙内流通道(Ca2+release-activated Ca2+，CRAC)以及参与回补胞内钙库的肌质网膜钙ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)和参与钙外排的胞膜钙ATP酶(plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)等。聚焦钙信号元件在AP中的作用为AP早期干预靶点提供可能性。

1．钙释放通道：内质网钙释放通道主要有IP3Rs和RyRs，研究发现IP3Rs、RyRs在人和小鼠胰腺腺泡细胞均有表达且呈极性分布[21-22]。IP3Rs有3个亚型，其中2型和3型主要表达于腺泡细胞顶部区域的内质网表面，RyRs主要是在心肌细胞等可兴奋细胞表达，在腺泡细胞基底区的内质网表面也有表达。当胞内磷脂酶C被激活，催化细胞膜表面的二磷酸磷脂酰肌醇，水解产生三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)，进而与IP3Rs结合，释放内质网里储存的钙离子进入细胞质并激活各种钙离子依赖性下游信号通路。Gerasimenko等[23]发现2型IP3R单敲除(IP3R2-/-)或2型和3型IP3R双敲除(IP3R2-/-IP3R3-/-)的胰腺腺泡细胞钙释放显著下降且胰蛋白酶原的异常活化亦随之减少；而Orabi等[24]发现，与野生型小鼠相比，IP3R2-/-小鼠雨蛙肽诱导的AP的严重程度差异无统计学意义。Huang等[25]的另一项研究显示，高剂量的咖啡因可通过抑制IP3Rs介导的钙释放，减少腺泡细胞钙超载，减轻多种小鼠AP模型的严重程度。Oribi等[24]多项研究表明RyRs介导的钙释放参与调控腺泡细胞内胰蛋白酶原的异常激活；RyRs特异性抑制剂丹曲林可降低雨蛙肽和胆汁酸诱导的AP的严重程度[26-28]。但是，钙释放通道在全身各脏器均广泛表达并发挥极为重要的生理功能，这导致其调节剂对心脏等重要脏器的不良反应极难避免。因此，以钙释放通道作为潜在靶点开发治疗AP的相关药物或干预手段的应用前景相对较弱。

2．钙内流通道：维持腺泡细胞内钙持续性升高主要依赖钙库操纵型钙内流(store-operated Ca2+entry, SOCE)。内质网钙库的排空诱导其膜上的钙传感蛋白(stromal interaction molecule 1, STIM1)向细胞膜转移，并激活细胞膜上低电压高选择性的钙激活钙内流CRAC通道。2006年2篇发表在Nature上的研究证实CRAC的基本组成蛋白为Orai1[29-30]。之后，Lur等[31]首先发现Orai1在胰腺腺泡细胞的基底部和侧部表达。Gerasimenko等[32]发现Orai1介导的持续性钙内流参与乙醇及其代谢物所致的腺泡细胞内胰蛋白酶原的异常活化和细胞坏死通路的激活，抑制Orai1可显著减轻钙超载相关的腺泡细胞损伤。Voronina等[33]发现Orai1介导的持续性钙内流在腺泡细胞空泡形成中发挥重要作用，抑制Orai1可阻止CCK或TLCS所致的腺泡细胞空泡化。笔者所在课题组首次使用新鲜分离的人胰腺腺泡细胞和体外分离的小鼠胰腺腺泡细胞进行研究，发现抑制Orai1可阻断TLCS诱导的病理性、持续性钙内流并减轻腺泡细胞内坏死通路激活；进一步研究发现抑制Orai1可显著减轻由雨蛙肽、棕榈油酸加乙醇、逆行胆胰管注射TLCS诱导的3种AP模型的严重程度，且早期(发病后1～2 h)给予Orai1抑制剂的疗效显著优于发病后6 h[34]。Waldron等[35]进一步发现Orai1抑制剂不仅可保护胰腺实质细胞，还可以通过降低中性粒细胞内活性氧的合成和促炎因子的表达来减轻AP患者的严重程度。上述研究中测试的Orai1抑制剂(商品名为Auxora)已在美国完成了二期临床试验，且研究结果表明Auxora用于治疗AP和SIRS是安全可行的[36-37]。值得注意的是，Ahuja等[38]研究发现Orai1具有调控腺泡细胞抗菌肽分泌的重要生理功能，特异性敲除胰腺腺泡细胞Orai1会导致小鼠肠道菌群紊乱甚至死亡。

瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels，TRPCs)是一种选择性较低的阳离子通道，表达于胰腺腺泡细胞，为另一个参与介导SOCE的通道蛋白家族。Ca2+、Na+等阳离子均可通过TRPCs蛋白家族进出腺泡细胞，参与维持细胞内稳态[39]。Muallem团队的两项研究解析了TRPC3在AP中的作用，他们发现全身性敲除TRPC3或使用TRPC3特异性抑制剂Pyr3可抑制腺泡细胞内持续性钙升高并阻止细胞内胰蛋白酶的异常激活，从而减轻腺泡细胞损伤并保护轻症胰腺炎[40-41]。但敲除或抑制TRPC3仅引起50%左右的钙内流下降，且在AP体内和体外模型中亦仅有部分保护作用，提示TRPC3并不是最主要的介导SOCE的通道，其对腺泡细胞“钙超载”相关的损伤调控作用相对有限，可能并不能有效减轻AP的严重程度。

胰管内压力升高一直被认为是多种病因如ERCP、胆石症、腹部外伤或胰腺肿瘤导致的胰管梗阻所致胰腺炎最主要的原因[42]。Noble等[43]通过向大鼠胰管输注造影剂模拟ERCP术后胰腺炎，发现低pH造影剂所致的胰腺中性粒细胞浸润和胰腺炎依赖于表达在神经元上的瞬时受体电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)的激活，使用TRPV1激动剂树脂毒素(resiniferatoxin，RTX)可显著减轻低pH造影剂所致的胰腺损伤。Romac等[44]运用胰管高压所致胰腺炎小鼠模型，揭示了胰管内压力增高通过激活压力敏感型离子通道Piezo1引起胰腺腺泡细胞内钙信号升高并诱发胰腺炎。该团队最新的研究进一步阐明了胰管高压可通过激活Piezo1引起腺泡细胞内短暂性钙升高，随后通过活化磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)激活TRPV4引起腺泡细胞内持续性钙升高，进而导致线粒体去极化、细胞内酶原异常活化及细胞坏死[45]。上述研究结果揭示了压力相关的离子通道及调控机制在胰腺炎中的重要作用，为进一步探明其作为AP早期干预靶点提供了初步的实验依据。

3．钙外排蛋白及线粒体依赖的ATP合成：胰腺腺泡细胞钙外排主要受PMCA调控。PMCA的活性依赖细胞内ATP水平，胰腺腺泡细胞的线粒体氧化磷酸化对维持细胞内ATP水平起关键作用。正常线粒体膜电位是维持线粒体氧化磷酸化和ATP合成的必要条件，而MPTP对于维持线粒体膜电位至关重要。Cyp D是线粒体基质蛋白肽基-脯氨酰顺反异构酶，参与调控MPTP的开放。抑制或敲除Cyp D可提高MPTP的开放阈值，维持线粒体膜电位和细胞内ATP的合成，进而抑制胰腺腺泡细胞坏死和AP[46-47]。笔者团队初步尝试以盾叶薯蓣等天然产物为原料分离纯化或化学修饰其母核，获得一系列具有抑制线粒体钙超载的活性化合物，揭示了盾叶薯蓣的提取物或开环化的薯蓣皂苷元通过抑制线粒体钙超载，减轻细胞内活性氧的产生，抑制MPTP的异常开放，从而抑制腺泡细胞坏死通路激活，减轻AP的严重程度[48-49]。另有研究报道，从金菊中提取的黄酮类化合物亦可通过核因子E2相关因子2/抗氧化反应原件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/antioxidant response element, Nrf-2/ARE)介导的抗氧化途径及维持线粒体的正常功能对AP起到保护作用[50]。

另一方面，Bruce团队研究发现胰岛素通过促进糖酵解重编程胰腺腺泡细胞的能量代谢方式来维持细胞内ATP水平及PMCA的活性，进而直接保护氧化应激或脂肪酸等所致的细胞坏死[51-52]。该团队的最新研究进一步揭示了内源性胰岛素在AP体外模型中的作用机制，主要是通过胰岛素受体引起Akt介导的磷酸果糖激酶的磷酸化来促进糖酵解[53]。上述研究结果表明直接增强或维持PMCA的活性亦可作为AP的治疗策略。PMCA是由10个跨膜区和4个主要的胞质区组成的单条多肽链，包括PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4a/b 4个亚型[54]。胰腺腺泡细胞主要表达PMCA1和PMCA4b。Wang等[55]发现PMCA4b是一种肾脏内源性分泌型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性胺氧化酶renalase的结合蛋白。Kolodecik等[56]研究发现血清renalase水平在AP早期显著下降，随着胰腺损伤的逐渐消退而恢复至正常水平，并进一步揭示外源性补充renalase通过与PMCA4b结合促进腺泡细胞钙外排来减轻雨蛙肽诱导的AP的严重程度[56]。

三、与钙信号相关的基因突变与胰腺炎

遗传因素在胰腺炎特别是急性复发性胰腺炎或CP的致病过程中起重要作用，主要的易感基因包括胰蛋白酶原基因(protease serine 1，PRSS1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型(serine protease inhibitor Kazal type1，SPINK1)、囊性纤维跨膜转导调控因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)、糜蛋白酶C(chymotrypsin C，CTRC)、钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)、紧密连接蛋白(claudin 2，CLDN2)等[57]。近年来，有不少研究分别报道了与钙信号相关的基因突变如CaSR、TRPV6、STIM1等参与胰腺炎的发生。CaSR是细胞膜受体，可以感知细胞外钙水平，在胰腺腺泡和导管细胞中均有表达[58]，CaSR通过触发导管电解质和液体的分泌从而监测和调节胰液中钙浓度[59]。Felderbauer等[60]首次报道CasR在第7外显子(R896H)中有一个错义突变，在第4外显子(F391F)和第7外显子(E790E)中有两个保守突变，与SPINK1联合突变增加了患胰腺炎的风险。Muddana等[61]研究发现CaSR突变普遍出现在中度至重度饮酒的CP患者中。TRPV6是一种高度选择性的离子通道，敲除TRPV6会造成钙稳态失衡，表现为肠道吸收钙离子降低、低体重、生育能力下降等。Masamune等[62]发现在非酒精性CP患者中TRPV6突变频率显著增高，尤其是突变体p.Glu575Lys和p.Arg345His会导致TRPV6功能性缺陷，作者进一步在雨蛙素诱导的胰腺炎小鼠模型中发现TRPV6 突变小鼠的胰腺炎病情比对照组小鼠更严重。Zou等[63]在中国人群中亦有类似发现。此外，Burgos等[64]发现CP中位于基质相互作用分子1(strmal interaction molecule 1,STIM1)蛋白的一个结构域和无菌α-motif结构域内的p.E152K突变增加了成纤维细胞和HEK293T细胞内质网钙的释放，导致钙稳态失调，酶原激活进而引起细胞坏死。上述研究从另一方面亦证实了细胞内异常钙信号和钙信号元件在胰腺炎发生中的重要地位。

四、钙调神经磷酸酶是转导胰腺损伤信号的钙信号下游效应分子之一

过去已报道的转导胰腺损伤细胞的钙信号下游效应分子包括钙调节蛋白(calmodulin，CaM)，钙依赖的蛋白激酶如蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的α、β、γ亚型，钙激活酶(calpains)和钙调神经磷酸酶等。Gerasimenk等[65]发现CaM可通过抑制2型和3型IP3R显著降低乙醇诱导的钙释放和胰蛋白酶原的异常活化。Han等[66]发现高浓度CCK刺激可引起腺泡细胞内钙离子浓度异常升高并活化PKC，促进CCK8趋化因子mob-1的表达和NF-κB的活化。钙依赖的钙激活酶calpain抑制剂可缓解胰腺炎的严重程度[67-68]。此外，Husain团队的多项研究发现，钙调神经磷酸酶在AP发生和发展中相对特异且发挥极为重要的调控作用[69-71]。钙调神经磷酸酶作为腺泡细胞内钙信号异常升高的关键效应分子，参与介导雨蛙肽及胆酸诱导的胰腺炎中胰蛋白酶原的异常激活，且钙调神经磷酸酶抑制剂可阻断PKC-δ亚型的转录，抑制NF-κB的转录激活并减轻胰腺炎的严重程度[72]。笔者所在课题组[15]通过建立胰管高压所致AP小鼠模型阐明短暂性胰管内压力增高引起腺泡细胞钙信号失衡、钙调神经磷酸酶异常活化和诱发胰腺炎的分子机制；通过胆胰管输注带有活化T细胞核因子启动子的生物荧光素酶报告腺相关病毒载体，实现了体内动态监测胰腺局部钙调神经磷酸酶的活化情况并发现短暂性胰管内压力升高会激活胰腺内钙调神经磷酸酶通路；进一步发现全身性敲除钙调神经磷酸酶催化亚基(CnAβ-/-)或腹腔注射钙调神经磷酸酶抑制剂FK506均显著减轻胰管高压所致AP的严重程度。团队另一项研究[73]则通过两种不同方式建立胰腺腺泡细胞特异性钙调神经磷酸酶敲除小鼠模型(Ela-CreERT2/Cnb1f/f和AAV6-Ela-iCre胆胰管输注到Cnb1f/f小鼠胰腺局部)，明确腺泡细胞来源的钙调神经磷酸酶在ERCP术后胰腺炎中起主要的调控作用，且在ERCP 术后胰腺炎造模的同时单次低剂量胰腺局部给予钙调神经磷酸酶抑制剂即可显著降低ERCP术后胰腺炎的风险。此外，钙调神经磷酸酶在全身各器官和组织广泛表达。Wen等[74]首次通过骨髓移植的方式建立骨髓特异性钙调神经磷酸酶敲除小鼠，发现表达于免疫细胞的钙调神经磷酸酶不影响AP时胰腺局部坏死的程度，而主要参与调控胰外器官功能不全，特别是胰腺炎相关的肺损伤；且AP时主要浸润于肺部并发挥重要调控作用的免疫细胞为中性粒细胞，抑制中性粒细胞钙调神经磷酸酶可显著抑制其趋化性和细胞内活性氧合成。来自美国宾夕法尼亚大学Thiruvengadam等[75]的一项临床研究进一步证实钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司联合吲哚美辛栓剂能安全有效地预防ERCP术后胰腺炎的发生。上述研究结果提示钙调神经磷酸酶抑制剂或可作为AP的早期治疗手段或ERCP术后胰腺炎的防治手段。

五、小结与展望

胰腺腺泡细胞钙超载被证实是AP发生的重要诱因。胰腺腺泡细胞内钙信号的转导受细胞内钙信号元件严格调控，这些钙信号元件或可作为AP早期治疗的干预靶点。钙库操纵型钙内流通道Orai1抑制剂作为目前唯一专门针对AP发病机制的在研新药，已在美国完成二期临床试验并有望成为第一个FDA批准的治疗AP的临床药物。随着基础研究的继续开展，针对钙信号元件如何参与调控AP发生、发展的认识和理解将进一步增强，并有望获得更多靶向细胞内病理性钙信号治疗AP的新策略和干预靶点，这对降低AP早期死亡率及提高患者长期生活质量具有重要的临床价值。

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