不同剂量丁苯酞对UUO小鼠肾组织Nrf-2表达的影响

曹义甫，王秀芬，王天智，解坤，刘翠红，李英

不同剂量丁苯酞对UUO小鼠肾组织Nrf-2表达的影响

曹义甫1，王秀芬2△，王天智1，解坤3，刘翠红1，李英2

目的 探讨不同剂量丁苯酞（NBP）对单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾间质纤维化的作用，并探讨核转录因子-E2相关因子2（Nrf-2）表达水平与肾间质纤维化的关联性。方法清洁级CD-1雄性小鼠72只随机均分为低剂量丁苯酞（NBPL）组、高剂量丁苯酞（NBPH）组、假手术（Sham）组和模型（UUO）组。除Sham组外，均制作UUO模型，NBPL、NBPH组自术后第1天始分别给予NBP 150 mg/（kg·d）、220 mg/（kg·d）灌胃。Sham及UUO组亦自术后第1天始均给予等量生理盐水灌胃，每天每公斤体质量入量恒定，直至处死。各组分别于术后第3、7、14天处死6只小鼠，取梗阻侧肾组织做免疫组化染色检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，Western Blot检测7 d和14 d时Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果免疫组化结果显示，UUO组Ⅰ型胶原蛋白的IOD值随时间延长呈增高趋势，Sham组、NBPL组和NBPH组呈降低趋势（P＜0.05）。UUO组、NBPL组和NBPH组各时点IOD值均较Sham组增高，NBPL、NBPH组较UUO组降低，且NBPH组低于NBPL组（P＜0.05）。Western Blot结果显示，7 d和14 d时，UUO组、NBPL组和NBPH组Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白IOD值均较Sham组增高；NBPL、NBPH组Nrf-2蛋白IOD值较UUO组升高，而Ⅰ型胶原蛋白降低；NBPL组Nrf-2的IOD值低于NBPH组，而Ⅰ型胶原蛋白高于NBPH组（均P＜0.05）。结论NBP对UUO小鼠肾间质纤维化有一定的改善作用，作用机制可能与上调肾组织Nrf-2的表达，下调Ⅰ型胶原蛋白的表达有关。

输尿管梗阻；疾病模型，动物；胶原Ⅰ型；丁苯酞；NF-E2相关因子2；肾间质纤维化

机体内氧化还原水平失衡是肾脏疾病重要的病理生理基础之一。氧化应激参与了肾间质纤维化的发生、发展，而肾间质纤维化可导致慢性肾衰竭［1］。因此，切断氧化应激途径可避免肾功能衰竭的发生、发展。近年来研究发现，核转录因子（NF）-E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）的抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）通路在机体的抗氧化应激中起关键作用；因此，干预Nrf-2的表达，可切断氧化应激途径，进而有可能阻止肾间质纤维化的发生、发展［2］。目前，尚少见通过此途径抑制肾间质纤维化的研究报道。丁苯酞（dl-3-n·butylphthalide，NBP）具有抗氧化、抗炎、保护线粒体等功能，在脑神经损伤治疗中被广泛应用，但在肾保护方面的研究鲜见。本研究拟通过建立单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）诱导的小鼠肾间质纤维化模型，探索不同浓度NBP对梗阻性肾病小鼠的肾保护作用，并分析梗阻性肾病小鼠肾脏中Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂COL1A1抗体（Santa Cruz），Nrf2抗体（Santa Cruz），GAPDH抗体（Santa Cruz），辣根酶标记抗兔IgG（ABCAM Ltd），辣根酶标记抗山羊IgG，生物素标记抗山羊IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；复日生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）；VECTASTAIN ABC试剂（Vector Laboratories公司）。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型的制备2个月龄、体质量为50 g左右的清洁级、雄性CD-1小鼠72只，购自河北中医学院动物中心，采用随机数字表法均分为低剂量NBP（NBPL）组、高剂量NBP（NBPH）组、假手术（Sham）组及模型（UUO）组。除Sham组外，余各组小鼠用10%水合氯醛以0.4 mL/100 g体质量行腹腔注射，充分麻醉后剪去左肾腰背部鼠毛，并以0.9%盐水擦洗，继而予以乙醇消毒皮肤。以左侧脊肋角旁开0.5 cm为手术部位，用外科剪刀剪开皮肤，沿脊柱扩大刀口，长约1.0～1.5 cm，逐层分离皮肤、皮下组织以及肌肉，暴露肾脏。以平头镊子提取肾周组织，充分暴露肾脏手术视野。并用镊子分离输尿管，用3-0缝合线分别从肾近极和远极结扎输尿管，并从中间离断输尿管。逐层缝合腹壁切口、腹膜肌层及皮肤层，对切口进行乙醇消毒。Sham组除不结扎输尿管外，其余同上述方法。UUO术后发现梗阻肾发生间质纤维化损害为模型制作成功。本组造模均成功。NBPL、NBPH组自术后第1天始分别给予NBP 150 mg（/kg·d）、220 mg（/kg·d）灌胃。Sham及UUO组亦自术后第1天始均给予等量生理盐水灌胃，每天每千克体质量入量恒定，直至处死。实验期间动物自由摄食水，每天注意观察小鼠的一般状况，有无饮食及活动异常。

1.2.2 标本的采集和处理各组分别于术后第3、7、14天各处死6只小鼠，取梗阻侧肾组织，生理盐水冲洗后置入10%中性福尔马林固定，分别应用80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2 h脱水透明，然后浸蜡、包埋、切片。备免疫组化染色；另取部分梗阻侧肾组织放入液氮中，-70℃冷冻保存以防止蛋白降解，待后续实验。

1.2.3 免疫组化检测Ⅰ型胶原蛋白表达水平使用二甲苯、梯度乙醇对组织切片分别进行脱蜡及水化，并应用自来水冲洗5 min左右，应用0.3%H2O2去离子水孵育30 min，再于缓冲液稀释的一抗中孵育30 min，缓冲液冲洗切片5 min；于滴加生物素标记的二抗中孵育30 min，缓冲液冲洗切片5 min；组织置于VECTASTAIN ABC试剂30 min，缓冲液冲洗切片5 min；组织在过氧化物酶底物溶液中孵育，达到所需的染色强度后自来水冲洗、复染、脱水至透明。使用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对免疫组织化学实验结果进行分析，每张切片随机抽取5个视野对肾组织的病变情况进行积分光密度（IOD）分析。

1.2.4 Western Blot检测Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白的相对表达水平分别于7 d和14 d时各组取500～600 mg肾组织加入1 mL提取液匀浆提取，1∶1稀释提取上清液，用考马斯亮蓝方法测定提取液的蛋白浓度，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并行蛋白质的电转移（水浴式电印迹）。放入5%牛血清白蛋白BSA的封闭液中，在室温条件下摇动4～5 h或静止过夜。加一抗稀释1∶250，室温摇动1～3 h或4℃过夜；Tween-PBS洗3次，每次振荡10 min。二抗结合，二抗稀释1∶6 500；室温摇动1～2 h。Tween-PBS洗3次，每次振荡10 min，使用ECL发光试剂反应后，洗膜、曝光、洗片。数码相机照相，使用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件，测定不同时间点、不同组条带的IOD值，以GAPDH为内参，测定Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，NBPH组的Nrf-2与Ⅰ型胶原蛋白关系采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肾脏组织病理肉眼观察Sham组肾脏颜色及大小正常，其余各组小鼠肾脏均有不同程度增大，其中尤以UUO组肾脏增大最为明显，NBPL、NBPH组肾脏外观大体变化均较UUO组轻。

2.2 各组Ⅰ型胶原蛋白免疫组化结果比较组内比较：随时间延长，UUO组IOD值呈增高趋势，Sham组、NBPL组和NBPH组呈逐渐降低趋势（P＜0.05）。组间比较：UUO组、NBPL组和NBPH组各时点IOD值均较Sham组增高，NBPL、NBPH组IOD值较UUO组降低，且NBPH组低于NBPL组（P＜0.05），见表1、图1。

Tab.1 Comparison of immunohistochemical staining results of typeⅠcollagen in renal tissue between four groups表1 各组肾组织Ⅰ型胶原蛋白的免疫组化染色结果比较（n=6，IOD×10-3，）

Tab.1 Comparison of immunohistochemical staining results of typeⅠcollagen in renal tissue between four groups表1 各组肾组织Ⅰ型胶原蛋白的免疫组化染色结果比较（n=6，IOD×10-3，）

＊P＜0.05；a与Sham组比较，b与UUO组比较，c与NBPL组比较，A与3 d比较，B与7 d比较，P＜0.05

F组别Sham组UUO组NBPL组NBPH组F 3 d 67.01±9.73 130.92±5.51a 120.76±38.67ab 110.80±33.91abc 27.801＊7 d 63.49±4.30A 158.90±18.50aA 103.61±0.10abA 90.22±8.30abcA 23.412＊14 d 60.11±4.70AB 217.00±56.40aAB 87.41±12.54abAB 69.81±35.32abcAB 19.109＊32.211＊16.201＊21.621＊23.010＊

2.3 Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白Western Blot检测结果比较7 d和14 d时，UUO组、NBPL组和NBPH组Nrf-2、Ⅰ型胶原蛋白IOD值均较Sham组增高；NBPL、NBPH组Nrf-2蛋白IOD值较UUO组升高，而Ⅰ型胶原蛋白降低；NBPL组Nrf-2的IOD值低于NBPH组，而Ⅰ型胶原蛋白高于NBPH组（均P＜0.05），见表2、图2。

Tab.2 Comparison of Nrf-2 and typeⅠcollagen expression levels between four groups表2 各组小鼠肾组织Nrf-2和Ⅰ型胶原蛋白相对表达水平比较（n=6，IOD×10-3，）

Tab.2 Comparison of Nrf-2 and typeⅠcollagen expression levels between four groups表2 各组小鼠肾组织Nrf-2和Ⅰ型胶原蛋白相对表达水平比较（n=6，IOD×10-3，）

＊P＜0.05；a与Sham组比较，b与UUO组比较，c与NBPL组比较，P＜0.05

组别Sham组UUO组NBPL组NBPH组FNrf-2 7 d 0.238±0.008 0.352±0.007a 0.445±0.011ab 0.614±0.019abc 98.256＊14 d 0.229±0.013 0.336±0.003a 0.453±0.005ab 0.703±0.022abc 109.904＊Ⅰ型胶原蛋白7 d 0.341±0.011 0.968±0.011a 0.750±0.005ab 0.565±0.006abc 99.106＊14 d 0.349±0.010 1.120±0.091a 0.693±0.006ab 0.439±0.008abc 110.036＊

2.4 相关性分析NBPH组Nrf-2与Ⅰ型胶原蛋白表达水平呈负相关（r=-0.841，P＜0.05）。

Fig.2 The Nrf-2 and type I collagen protein expressions in three groups图2 各组小鼠肾组织中Nrf-2和Ⅰ型胶原蛋白表达

3 讨论

3.1 Nrf-2的抗氧化应激机制Nrf-2是亮氨酸拉链转录激活因子家族（CNC）成员之一，正常生理条件下，Nrf-2在细胞质中与Keap1结合，作为E3泛素连接酶的适配底物；当受到外界氧化应激因子刺激后，Nrf-2与Keap1解偶联进入细胞核，启动下游基因转录翻译，发挥相应的调控作用。研究显示，Nrf-2对多种细胞及组织器官具有保护作用，能对抗多种疾病的病理状态［3-4］，除了可对抗心脑血管疾病、肺纤维化、肝脏纤维化等疾病以外，还对肾脏疾病如缺血再灌注肾损伤、药物性肾损伤、肾脏纤维化等具有保护作用［5-6］。Cho等［7］研究显示，激活Nrf-2和上调ARE介导的抗氧化应激相关酶类基因均可以减轻肾组织纤维化、抑制活性氧簇（ROS）。

3.2 NBP的抗氧化应激、抗肾间质纤维化作用研究显示，NBP可通过多种机制减轻缺血性细胞和组织损伤，具有较强的抗组织缺血作用，可明显缩小局部脏器缺血的损伤面积，改善机体能量代谢和缺血区的微循环和血流量，抑制组织细胞凋亡［8］。NBP可能通过降低花生四烯酸含量，提高脑血管内皮一氧化氮（NO）和前列腺环素（PGI2）的水平，抑制谷氨酸释放，降低细胞内钙浓度，从而通过抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制发挥上述作用［9］。目前，仍缺乏NBP对肾间质纤维化保护作用机制的系统研究。在对体外氧糖剥夺的内皮细胞抗氧化应激的研究中发现，NBP可以抑制线粒体内过多的过氧化反应［10］。另有研究显示，NBP可减少线粒体ROS和过氧化亚硝酸盐的产生，并可减少ROS诱发的基质金属蛋白酶（MMP）的降低，阻断因MMP丢失而触发的进一步的细胞损伤及凋亡［11］。这些研究提示NBP可通过抑制氧化应激的途径防止线粒体受损，进一步减少细胞凋亡、减少细胞纤维化的发展。

3.3 NBP可上调Nrf-2的表达、抑制Ⅰ型胶原蛋白的形成UUO的特点是：肾呈进行性小管萎缩及间质纤维化，小管和间质细胞增生，肾实质巨噬细胞、单核细胞浸润，这些改变最终导致小管间质纤维化和小管萎缩，肾实质被纤维组织取代，而肾小球相对不受影响。肾间质纤维化的病程漫长，病因复杂，加上取材的局限性，对其病理过程的动态研究比较困难［12］。因此，本研究仅观察3个时间点，希望能从中找到疾病演变的规律性。本研究Ⅰ型胶原蛋白的免疫组化结果显示，随时间延长，UUO组IOD值呈增高趋势，Sham组、NBPL组和NBPH组呈逐渐降低趋势；UUO组、NBPL组和NBPH组各时点IOD值均较Sham组增高，NBPL、NBPH组IOD值较UUO组降低且NBPL组高于NBPH组，表明在应用不同浓度NBP治疗后，肾间质损伤及肾小管上皮细胞在第7天均开始改善，Ⅰ型胶原蛋白表达开始减少，14 d时疗效更佳，且NBPL组在7 d、14 d的治疗效果不如NBPH组。Western Blot研究结果显示，不同时间点在UUO组、NBPL组、NBPH组小鼠肾组织中2种蛋白均有表达，而NBPL、NBPH组较UUO组Nrf-2蛋白表达进一步增多且NBPL组低于NBPH组，而3组Ⅰ型胶原蛋白与Nrf-2蛋白表达趋势相反，笔者推测NBP治疗肾间质纤维化的机制可能与激活Nrf-2信号通路有关，提示在一定浓度范围内，在抑制肾间质纤维化的发生、发展中，NBP浓度越高，氧化应激反应分子Nrf-2越易被激活，其表达也随之增高，抑制Ⅰ型胶原蛋白的形成也越明显，短期内抗氧化作用越强，但NBP最优剂量需要进一步探讨。相关性分析显示，Nrf-2与I型胶原蛋白表达水平呈负相关，进一步验证了上述作用机制。

综上所述，Nrf-2/ARE通路可能是阻止氧化应激损伤的重要靶点。NBP的抗氧化应激作用有望成为缓解肾间质纤维化的新途径。其作用机制可能是激活Nrf-2氧化应激通路，抑制ROS产生，从而缓解肾间质损伤，最终达到延缓肾间质纤维化的目的。

（图1见插页）

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（2016-06-12收稿 2016-08-11修回）

（本文编辑 陆荣展）

The effects of different doses of butylphthalide on Nrf-2 expression in mouse model with unilateral ureteral obstruction

CAO Yifu1,WANG Xiufen2△,WANG Tianzhi1,XIE Kun3,LIU Cuihong1,LI Ying2
1 Department of Nephrology,the Third Hospital of Shijiazhuang,Shijiazhuang 050031,China；2 The Third Hospital of Hebei Medical University；3 Shijiazhuang Cardio-Cerebrovascular Disease Hospital△

ObjectiveTo explore the impact of different doses of butylphthalide on renal interstitial fibrosis in mice with obstructive nephropathy,and to discuss the correlation between Nrf-2 expression level and renal interstitial fibrosis.MethodsTotally 72 male CD-1 mice of clean grade were selected and randomly assigned into 4 groups:sham operation group(Sham),model group(UUO),low dose of butylphthalide group(NBPL)and high dose of butylphthalide group(NBPH). In addition to the control group,UUO model was established in other three groups.NBPL group was given NBP 150 mg/(kg· d)by gavage since postoperative day 1，NBPH group was given NBP 220 mg/(kg·d)by gavage.Sham group and UUO group were given equal volume of saline by gavage.Six mice were sacrificed at the third,7th,14th day,respectively.The obstructive renal tissue was selected for immunohistochemical staining and Western blot assay.The expression levels of Nrf-2 and typeⅠcollagen were detected by Western blot assay.ResultsThe IOD value of typeⅠcollagen was increased with time in UUO group,and which showed a gradual decreasing trend in Sham group,NBPL group and NBPH group(P＜0.05).The IOD values at different time points were significantly higher in UUO group,NBPL group and NBPH group compared to those of Sham group.The IOD values were significantly decreased in NBPL and NBPH groups than that of UUO group,and IOD value was lower in NBPH group than that of NBPL group(P＜0.05).Western blot assay showed that IOD values of Nrf-2 and typeⅠcollagen at 7 d and 14 d were increased in UUO group,NBPL group and NBPH group compared with those of Sham group.The IOD values of Nrf-2 protein were increased,and IOD values of typeⅠcollagen were decreased,in NBPL group and NBPH group than those of UUO group.The IOD value of Nrf-2 protein was decreased in NBPL group than that of NBPH group,but the IOD value of typeⅠcollagen was increased in NBPL group than that ofNBPH group(P＜0.05).ConclusionNBP can improve renal interstitial fibrosis in UUO mice,which may be related with the increased expression of Nrf-2 and the down-regulated expression of type I collagen.

ureteral obstruction；disease models,animal；collagen typeⅠ；dl-3-n·butylphthalide；NF-E2-related factor 2；renal interstitial fibrosis

R692

A

10.11958/20160533

河北省医学科研重点课题计划（ZD20140125）

1石家庄市第三医院肾内科（邮编050031）；2河北医科大学第三医院（西院）肾内科；3石家庄市心脑血管病医院

曹义甫（1977），男，主治医师，硕士，主要从事肾间质纤维化、肾小球疾病、血液透析通路研究

△通讯作者E-mail:wangxiufen@medmail.com.cn