法舒地尔对蛛网膜下腔出血后大鼠脑皮质Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

缪春明，沈维高，王雷，魏盾

法舒地尔对蛛网膜下腔出血后大鼠脑皮质Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

缪春明，沈维高，王雷，魏盾△

目的 探讨法舒地尔对蛛网膜下腔出血（SAH）后大鼠脑皮质B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和Bax蛋白表达的影响。方法30只大鼠随机均分为假手术组、SAH组及SAH+法舒地尔组。采用枕大池二次注血法制备大鼠SAH模型，假手术组将自体血替换为生理盐水，SAH+法舒地尔组为第2次注血后30 min腹腔注射法舒地尔注射液，剂量为3 mg/kg。24 h后比较各组大鼠术后的一般情况和神经行为学评分，TUNEL染色法观察脑皮质细胞凋亡情况，免疫组化染色和Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果与假手术组相比，SAH组和SAH+法舒地尔组大鼠出现明显的神经运动功能障碍体征；SAH组神经行为学评分（2.68±0.31）低于假手术组（5.00±0.00），SAH+法舒地尔组（3.27±0.35）高于SAH组（P＜0.05）。SAH组和SAH+法舒地尔组均可见明显的神经细胞凋亡，且SAH+法舒地尔组凋亡程度轻于SAH组。SAH组的Bcl-2表达水平低于假手术组，而Bax表达水平高于假手术组（P＜0.05）；SAH+法舒地尔组Bcl-2表达水平较SAH组升高，而Bax表达量较SAH组降低（P＜0.05）。结论法舒地尔可明显改善SAH引起的神经功能损伤，其作用机制可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达有关。

蛛网膜下腔出血；基因，bcl-2；bcl-2相关X蛋白质；细胞凋亡；法舒地尔

蛛网膜下腔出血（subarachnoid haemorrhage，SAH）是神经科最常见的急症之一，因脑血管痉挛导致脑组织缺血、缺氧，从而进一步造成急性脑损伤，是SAH致残率和致死率高的主要原因［1］。B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和Bax是与脑缺血神经元凋亡关系最密切的凋亡调控基因，Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是促调亡基因［2］，目前，在SAH的发生、发展中，Bcl-2/Bax的表达情况仍未明确。法舒地尔作为一种新型钙离子通道阻滞剂，在临床上广泛用于SAH后脑血管痉挛等引起的缺血性脑血管疾病治疗，具有神经保护作用［3］。然而，法舒地尔的神经保护作用是否与调节Bcl-2/Bax的表达有关尚未明确。本研究通过建立大鼠SAH模型，探讨法舒地尔对SAH大鼠脑皮质Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，以期为临床治疗脑血管疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂盐酸法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司）；Bcl-2抗体、Bax抗体、β-actin抗体、驴抗鼠IgG二抗试剂盒（美国Santa Cruz公司）；DAB显色增强剂（美国Sigma公司）；TUNEL试剂盒（美国Roche公司）；其余动物实验、免疫组织化学实验及Western blotting实验所需的常规试剂均购自碧云天公司。

1.2 模型制作与分组清洁级健康雄性Wistar大鼠30只（吉林大学实验动物研究中心），10周龄，体质量（250±20）g，采用随机数字表法均分为假手术组、SAH组及SAH+法舒地尔组。各组实验动物均经10%水合三氯乙醛以300 mg/kg腹腔麻醉后俯卧位固定于实验操作台上，项部剪毛备皮消毒，剪开自枕外隆凸至第二颈椎处的皮肤，钝性分离各层组织，暴露寰椎，观察到白色坚韧的寰枕膜后，充分止血，生理盐水纱布覆盖。采用枕大池二次注血法制备大鼠SAH模型，分别在第1天和第2天于眼球后静脉丛抽取无抗凝自体血0.3 mL和0.2 mL，经环枕膜注入枕大池，使之形成SAH模型，术后缝合切口，保持尾高头低位30 min，放入笼中自然苏醒，自由摄食和饮水。按照分组不同，假手术组将自体血替换为生理盐水，SAH+法舒地尔组为第2次注血后30 min腹腔注射法舒地尔注射液，剂量为3 mg/kg。建模成功标准：观察到实验动物出现明显的神经行为障碍，神经行为学评分＜3分［4］，本组模型制作均成功。

1.3 神经行为学评分各组大鼠于二次注血后24 h采用Loeffler的神经行为学5分制评分法［4］评估其神经行为情况，评分标准为：5分，当抓住大鼠背部时，能正常运动，在5 s内翻身；4分，自主运动减少，5 s内能翻身；3分，大于5 s翻身；2分，不能翻身；1分，不能运动。

1.4 免疫组织化学染色法观察各组Bcl-2、Bax的表达情况及TUNEL法观察神经细胞的凋亡情况各组在神经行为学评分后，各取5只麻醉，采用中性福尔马林经心脏灌注固定，取脑组织做冰冻切片，按照免疫组化试剂盒说明书步骤，染色观察凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达情况；同时，采用TUNEL法观察神经细胞的凋亡情况。细胞呈黄色或棕黄色染色时即可判断为阳性染色，每组实验动物切片随机抽取5个高倍镜视野，比较阳性染色细胞数量情况。

1.5 Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况各组在神经行为学评分后，采用断颈法处死每组余下的各5只，快速取脑皮质组织，提取蛋白并测定蛋白浓度，每孔加样40 μg进行电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，分别孵育一抗Bcl-2、Bax和内参β-actin于4℃过夜，驴抗鼠IgG二抗37℃孵育1 h，滴加ECL化学发光试剂，于Bio-Rad成像系统中显影并采集图像，读取灰度值，目的条带灰度值分别与内参条带灰度值进行比较。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况SAH组大鼠麻醉苏醒后的神经运动障碍体征明显，主要表现为反应迟钝、嗜睡、活动减少、精神状态差、球结膜充血、毛发杂乱，摄食饮水量明显少于术前，尤其是二次注血后，上述表现更明显，但未发现偏瘫或截瘫大鼠。SAH+法舒地尔组第一次注血麻醉苏醒后的表现与SAH组基本相似，二次注血苏醒后的上述表现要明显轻于SAH组。假手术组麻醉苏醒后仅出现精神状态稍差，摄食饮水活动略有减少，其余表现均不明显。

2.2 法舒地尔对SAH大鼠神经行为学的影响假手术组、SAH组及SAH+法舒地尔组的神经行为学评分分别为（5.00±0.00）、（2.68±0.31）及（3.27±0.35）分，差异有统计学意义（F=7.843，P＜0.05），其中SAH组低于假手术组、SAH+法舒地尔组（P＜0.05）。

2.3 舒地尔对SAH大鼠皮质细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响免疫组化结果显示，假手术组和SAH+法舒地尔组内均可见Bcl-2阳性细胞，主要在细胞浆内呈棕黄色表达，SAH组未见明显的Bcl-2阳性细胞。SAH组和SAH+法舒地尔组内均可见Bax阳性细胞，且SAH组阳性细胞数明显多于SAH+法舒地尔组，假手术组未见明显的Bax阳性细胞。TUNEL法标记神经细胞凋亡结果显示，假手术组未见明显的TUNEL阳性细胞，SAH组和SAH+法舒地尔组内均可见TUNEL阳性细胞，且SAH组阳性细胞数明显多于SAH+法舒地尔组。见图1。

2.4 法舒地尔对SAH大鼠脑皮质Bcl-2和Bax蛋白表达的影响SAH组的Bcl-2表达水平低于假手术组，而Bax表达水平高于假手术组（P＜0.05）；SAH+法舒地尔组Bcl-2表达水平较SAH组升高，而Bax表达量较SAH组降低（P＜0.05）。见图2、表1。

Fig.1 The effect of fasudil on the expressions of Bcl-2 and Bax and apoptosis in cerebral cortex in SAH rats图1 法舒地尔对SAH大鼠皮质Bcl-2、Bax的表达和细胞凋亡的影响

Fig.2 The effect of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of SAH rats图2 法舒地尔对SAH大鼠皮质Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响

Tab.1 The effect of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of SAH rats表1 法舒地尔对SAH大鼠皮质Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（n＝5，）

Tab.1 The effect of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of SAH rats表1 法舒地尔对SAH大鼠皮质Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（n＝5，）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与SAH组比较，P＜0.05；SAH+法舒地尔组不与假手术组比较

组别假手术组SAH组SAH+法舒地尔组F Bcl-2/β-actin 0.37±0.08 0.09±0.03a 0.16±0.04b 8.114＊＊Bax/β-actin 0.13±0.04 0.24±0.03a 0.15±0.02b 7.902＊＊

3 讨论

随着医疗技术的不断发展，临床对SAH的诊断取得了很大的进步，但对该病的病理生理学机制仍未阐明，且临床治疗效果仍不满意，SAH致残率和致死率均较高。因此，探讨该病的发生机制，寻求有效的治疗方案对挽救患者生命，提高患者生存质量具有重要意义［5］。另外，建立简便易行、能模拟临床发病过程且重复性好的动物模型，对该疾病的研究至关重要。研究显示，大鼠的脑动脉血管结构与人类相似，是建立SAH模型的较理想动物［6］。另有研究认为，采用枕大池二次注血法建立SAH模型是研究该疾病的可靠且理想的方法，已广泛应用于该疾病的相关研究［4］。因此，本组研究采用该方法建立SAH模型，且结果显示大鼠出现SAH的典型表现，神经行为学评分显示SAH组大鼠出现明显的神经功能障碍，表明模型复制成功，在此基础上的研究结果可靠。

研究普遍认为，SAH可引起脑血管痉挛，进而使脑组织发生缺血缺氧等系列反应，是导致该疾病患者出现神经功能损害的重要原因［7］。其中，中枢神经细胞凋亡是导致神经功能障碍的重要发病机制，Bcl-2和Bax为与神经元凋亡关系最为密切的一组凋亡相关基因，在SAH神经功能损伤中发挥重要作用。Bcl-2抗凋亡作用与其能保护线粒体的稳定性，抑制细胞色素c和凋亡诱导因子释放有关；而Bax与Bcl-2相反，具有促进凋亡的作用，通过与线粒体上Bcl-2蛋白形成二聚体发挥作用，当Bax高表达时，形成同源二聚体的Bax/Bax促进凋亡，Bcl-2高表达时形成异源二聚体Bcl-2/Bax可以抑制凋亡的发生［2］。

钙离子拮抗剂是临床上预防和治疗SAH后脑血管痉挛的有效手段，可有效阻止钙离子进入细胞内、抑制平滑肌收缩，达到解除血管痉挛之目的，从而保护了脑神经元，稳定其功能并增进脑血灌流，改善脑供血，提高细胞对缺氧的耐受力［8］。尼莫地平是目前临床公认的对SAH后脑血管痉挛有效的药物，是用于治疗SAH的最具代表性药物之一［9］。笔者前期研究发现，发生SAH时，脑组织中的促凋亡相关蛋白Bax表达明显升高，抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达亦明显下降，并且这两者的表达变化与SAH脑损伤密切相关［4,10］。因此，尼莫地平可以调节SAH大鼠组织中Bcl/Bax的表达水平，有助于减轻脑损伤，提示钙离子拮抗剂可能通过抑制凋亡而发挥神经保护作用。但临床发现，尼莫地平虽然对缓解脑血管痉挛具有较好的疗效，但存在较多的不良反应，影响了其治疗效果［9］。法舒地尔是一种新型的细胞内钙离子拮抗剂，属于Rho激酶抑制药物，对促进神经功能的恢复，减轻临床症状，减少病残率有一定疗效。临床研究显示，法舒地尔治疗SAH的疗效与尼莫地平相当，且不良反应更少，但其临床作用机制仍未阐明［10］。有研究显示，法舒地尔可有效降低血脑屏障的通透性，并通过缓解脑血管痉挛，增加脑血流量，从而产生神经保护作用［11］。另有研究认为，法舒地尔可以抑制创伤后脑组织的凋亡而发挥脑保护作用［12-13］。但法舒地尔对凋亡的调节作用是否也是通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达来实现的，目前尚少见相关研究报道。

本组研究一般情况观察和神经行为学评分结果显示，法舒地尔减轻了SAH引起的神经损伤；TUNEL法标记皮质细胞的凋亡情况研究结果显示，SAH+法舒地尔组的凋亡程度较SAH组明显降低；免疫组织化学染色法结果显示，SAH+法舒地尔组的Bcl-2阳性细胞数多于SAH组、Bax阳性细胞少于SAH组；Western blotting法检测蛋白表达结果显示，应用法舒地尔干预后，SAH大鼠的Bcl-2表达水平明显上升，Bax表达水平明显下降，表明在SAH后应用法舒地尔，实验动物脑组织的凋亡程度降低，可明显改善SAH引起的神经功能损伤，因此，其作用机制可能是下调了促凋亡基因的表达，同时上调了抗凋亡基因的表达。

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（2016-07-19收稿 2016-08-29修回）

（本文编辑 陆荣展）

Effects of fasudil on the expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of rats with subarachnoid hemorrhage

MIAO Chunming,SHEN Weigao,WANG Lei,WEI Dun△
Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Beihua University,Jilin 132011,China△

ObjectiveTo investigate the effects of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of model rats with subarachnoid hemorrhage(SAH).MethodsThirty rats were divided into sham operation group,SAH group and SAH+fasudil group,10 rats in each group.Double injection of blood into occipital cistern method was used for SAH model in SAH group and SAH+fasudil group.In the sham operation group,the blood injection was instead by normal saline.In the SAH+fasudil group,at 30 min after the second injection of blood,rats were administrated with intraperitoneal injection of fasudil at a dose of 3 mg/kg.The general situation,neurological score,TUNEL staining for cortex cell apoptosis,immune histochemical staining and Western blotting assay for Bcl-2 and Bax protein expression were compared 24 h after the operation between the three groups.ResultsCompared with the sham operation group,rats in SAH group and SAH+ fasudil group appeared obvious neurological deficits.The neurological score was significantly lower in SAH group(2.68± 0.31)than that of sham operation group(5.00±0.00).The neurological score was significantly higher in SAH+fasudil group (3.27±0.35)compared with that of SAH group(2.68±0.31,P＜0.05).There was obvious cell apoptosis in SAH group and SAH+fasudil group,and the apoptosis was less in SAH+fasudil group than that of SAH group(P＜0.05).The level of Bcl-2 expression was significantly lower in SAH group than that of sham operation group,and Bax expression was significantly higher in SAH group than that of sham operation group(P＜0.05).The level of Bcl-2 expression was significantly higher in SAH+fasudil group than that of SAH group,but Bax expression was significantly lower in SAH+fasudil group than that of SAH group(P＜0.05).ConclusionFasudil can improve the neurological damage in rats with SAH,which may be related with the regulation of apoptosis related proteins Bcl-2 and Bax.

subarachnoid hemorrhage;genes,bcl-2;bcl-2-associated X protein;apoptosis;fasudil

R651.1

A

10.11958/20160705

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究［吉教科合字（2012）第149号］

北华大学附属医院神经外科（邮编132011）

缪春明（1967），男，主任医师，博士，硕士研究生导师，主要从事脑外科基础临床研究

△通讯作者E-mail：miaochunming218@163.com