OSAS模式IH对肺癌细胞系YAP以及P-YAP表达的影响

薛震，李莲，任方元，姜芳馨，陈宝元，曹洁△

OSAS模式IH对肺癌细胞系YAP以及P-YAP表达的影响

薛震1，李莲1，任方元1，姜芳馨2，陈宝元1，曹洁1△

目的 探讨阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）模式间歇低氧（IH）对肺癌细胞系A549细胞YES相关蛋白（YAP）及磷酸化YAP（P-YAP）表达的影响。方法IH分别处理A549细胞1 h、3 h、6 h（IH1组、IH3组、IH6组），IH频率为：5%O2300 s，21%O2300 s，并设置常氧对照组（N组）。qRT-PCR检测YAP mRNA表达；Western blot检测YAP及P-YAP蛋白表达。结果IH1组（2.50±0.18）、IH3组（4.07±0.25）、IH6组（9.18±0.58）YAP mRNA的相对表达量显著高于N组（1.00±0.01），差异有统计学意义（均P＜0.05），IH1组、IH3组、IH6组YAP蛋白的表达量较N组上调，并随暴露时间增加而上调；IH1组、IH3组、IH6组P-YAP蛋白的表达量较N组下调，并随暴露时间增加而下调。结论YAP信号通路可能在OSAS模式IH促进肿瘤发生发展的过程中起重要的调控作用。

睡眠呼吸暂停,阻塞性；细胞低氧；肺癌细胞系A549细胞；YES相关蛋白；磷酸化YAP；实时荧光定量聚合酶链式反应；蛋白质免疫印迹法

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是以睡眠状态下出现的多发的、短暂的睡眠呼吸暂停和低通气为特征的一类疾病，其核心与重要的生理学基础是间歇低氧（intermittent hypoxia，IH），其IH以高频率地发生，导致严重的低血氧和大幅度血氧的变化为特点［1］。OSAS是一个系统性疾病，可以引起包括呼吸系统、心血管系统、内分泌系统、泌尿生殖系统等多个系统或器官的损害［2］。严重OSAS患者若未经过规范的治疗，5年病死率可高达13%左右［3］。近年流行病学研究发现，OSAS患者的肿瘤发病率和死亡率增加，且与IH有关［4］；后续动物实验也证实OSAS可以促进小鼠体内肿瘤的生长和转移［5］，但是目前关于IH促进肿瘤发生和进展的分子机制尚不清楚。YAP即YES相关蛋白，是一种在胞内起连接蛋白和转录共激活作用的重要因子，在Hippo信号通路中起着关键的调控作用，而Hippo信号通路与肿瘤的发生发展有密切关系［6］。正常情况下，YAP以磷酸化形式（P-YAP）存在于胞浆中，当其上游的Hippo信号调控发生异常时，P-YAP进行去磷酸化，进入细胞核内，并作为转录共激活因子而促进细胞的增殖，这是多种肿瘤发生发展的重要机制之一［7］。本实验将初步探讨OSAS模式IH对A549肺癌细胞系YAP和P-YAP表达的影响，为揭示OSAS促进肿瘤发生发展的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料人肺癌细胞可传代细胞株A549由天津南开大学生命科学院肺发育和疾病实验室馈赠。21%的O2与5%的O2混合气体（天津六方气体有限公司）。O2、CO2浓度监测仪（瑞士Hamilton公司）。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（美国Gibco公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），M-MLV逆转录酶（美国Promega Leiden公司），SYBR®Select Master Mix（美国AMBION公司），YAP、内参β-actin实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物（上海生工生物工程技术服务有限公司），YAP、P-YAP抗体（美国Santa Cruze公司），β-actin抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养A549细胞用含有10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行培养。待细胞长至70%～80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化并以1∶3传代，传至3～5代后，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打制成单细胞溶液，按照2 mL/孔接种于P35培养皿中，继续上述条件培养，待细胞长至70%～80%融合时，采用无血清培养基冲洗，调整无血清培养基至1 mL/孔，继续培养24 h后暴露。

1.2.2 暴露方式用O2、CO2浓度监测仪检测培养舱中O2、CO2浓度。暴露装置采用Visual C++语言编制程序（呼吸仿真系统1.0），设置所需低氧/复氧循环。IH频率为低氧300 s、复氧300 s，控制低氧时舱内浓度最低为5%，复氧时浓度为21%。IH组给予1 h、3 h、6 h（IH1、IH3、IH6）的低氧/复氧刺激，对照组细胞（N）放置在正常细胞培养箱中培养。

1.2.3 qRT-PCR用TRIzol法提取暴露细胞总RNA后分装，利用M-MLV逆转录酶将总RNA反转录为cDNA，然后SYBR®Select Master Mix进行qRT-PCR，PCR反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性40 s，60℃复性30 s，72℃延伸30 s，循环40次；72℃延伸7 min。以β-actin为内参来校正目的基因表达量。根据目的基因和内参β-actin的相对表达绘制柱状图表。引物设计见表1。

Tab.1 Primers for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物列表

1.2.4 Western blot分析收集暴露后的细胞，在4℃、12 000 r/min离心机上离心15 min，取上清，用BCA试剂盒测定蛋白质浓度后，加入5×sample buffer，100℃煮5 min，根据蛋白浓度取一定量蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳分离，恒定电压100 V，时间100 min，湿转法将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，后分别加入相应抗体，4℃冰箱孵育过夜。第2天TBST洗膜5次，7 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育4 h后洗膜，ECL显影。

1.3 统计学方法使用SPSS 16.0统计软件处理，数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSAS模式IH对A549肺癌细胞系YAP表达的影响qRT-PCR结果显示，IH1组（2.50±0.18）、IH3组（4.07±0.25）、IH6组（9.18±0.58）的YAP mRNA相对表达量较N组（1.00±0.01）均显著增高（P＜0.05），见图1A。Western blot结果显示，IH1、IH3、IH6组YAP蛋白的表达量较N组均显著增高，且其表达量随着IH处理时间增加而逐步增加，见图1B。

2.2 OSAS模式IH对A549肺癌细胞系P-YAP表达的影响Western blot分析结果示，IH1、IH3、IH6组P-YAP蛋白的表达量较N组低，且基本随着IH处理时间增加而逐步降低，见图1B。

3 讨论

OSAS是一种十分常见的睡眠呼吸疾病，因其发生在患者难以感知的睡眠过程当中，导致不容易被发现。OSAS易合并包括呼吸、循环、血液等在内的各种其他系统疾病，为全身性疾病。2007年Abrams［8］探讨了肿瘤与OSAS的关联，认为肿瘤可能与OSAS模式IH有关。2012年美国威斯康辛的一项队列研究报道了OSAS患者肿瘤病死率升高，与对照组相比，轻、中、重度OSAS的病死率分别达到1.1倍、2.0倍、4.8倍，去除如年龄、性别、腰围、吸烟史、体质指数（BMI）等影响因素后，患者肿瘤病死率仍与OSAS有关［9］。2013年美国Harvard医学院在一项长达二十余年的观察性研究中发现，睡眠较正常人时间长且伴有打鼾者的结肠癌发病率上升，推测可能与患者长期处于OSAS模式IH环境有关［10］。后续相关流行病学研究及动物实验均证实OSAS模式IH可促进肿瘤的转移与进展［11］，但是关于其具体机制的相关研究仍然较少。Hippo信号通路与众多严重疾病尤其是肿瘤密切相关，该通路已经被证实参与了多个器官肿瘤的进展过程［12］。YAP是此信号通路下游的一个效应因子，YAP可以进入细胞核并与细胞核内转录因子结合，启动下游基因转录与蛋白质的合成，YAP在Hippo信号通路中处于关键枢纽地位［13］。Hippo-YAP信号通路最初发现于果蝇体内，哺乳动物体内该通路主要由Mst1/2、WW45、LAST1/2、Mob、YAP等构成，其中YAP处于关键调控环节［14］。人体内Hippo-YAP信号通路通过负性调控其下游的转录共激活因子YAP的活性来抑制细胞的生长、分化、凋亡［15］。Hippo-YAP信号通路失调可以引起肿瘤的发生与进展，这在胃癌等肿瘤的发生发展中已经得到了证实［16］。Steinhardt等［17］也证实YAP在结肠腺癌、肺腺癌等肿瘤中高度表达。Wang等［18］的一项研究发现在92例非小细胞肺癌中，YAP蛋白的表达阳性率可高达66.3%。正常情况下，YAP蛋白表达于胞浆与胞核中，P-YAP蛋白主要表达于胞浆中，YAP发挥致癌基因作用的先决条件是去磷酸化并进入细胞核，即YAP蛋白致癌活性的大小取决于其磷酸化状态［19］。本研究中检测不同IH暴露时间下A549细胞中YAP、P-YAP蛋白表达量，发现IH1、IH3、IH6组YAP蛋白的表达量较N组均显著增高，P-YAP蛋白的表达量较N组均显著降低。这表明OSAS模式IH时，细胞内更多的YAP处于非磷酸化状态，以更多地进入细胞核内促进下游癌基因的表达；且本研究还发现YAP mRNA的表达量、YAP蛋白的表达量随IH暴露时长增加而逐步增加，P-YAP蛋白的表达量随IH暴露时长而逐步降低，这提示OSAS模式IH时间越长肿瘤发展转移的风险可能会增加。

Fig.1 Effects of intermittent hypoxia with different exposure time points on the expression levels of YAP and P-YAP in A549 cell lines图1 不同的IH处理时长对A549细胞中YAP及P-YAP表达量的影响

综上所述，OSAS模式IH致使Hippo-YAP信号通路中YAP表达上调、P-YAP表达下降，这可能为OSAS模式IH促进肿瘤进展及临床OSAS肿瘤患者病死率增加的原因之一，且肿瘤进展程度可能与IH暴露时间有关。OSAS患者肿瘤发病率和病死率增高的分子作用机制十分复杂，本研究显示YAP信号通路可能在其中扮演着重要角色，为进一步研究提供了新的思路和方向。

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（2016-09-10收稿 2016-10-18修回）

（本文编辑 闫娟）

Effects of OSAS model IH on the expressions of YAP and P-YAP in lung cancer cell lines

XUE Zhen1,LI Lian1,REN Fangyuan1,JIANG Fangxin2,CHEN Baoyuan1,CAO Jie1△
1 Department of Respiratory Medicine,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China; 2 College of Life Sciences,Nankai University△

ObjectiveTo explore the effect of obstructive sleep apnea syndrome(OSAS),OSAS-like intermittent hypoxia(IH）on the expression levels of P-YAP and YAP in A549 lung cancer cell lines.MethodsA549 cells were treated with IH exposure(exposed to 5%O2for 300 seconds and 21%O2for 300 seconds)for 1,3 and 6 h(IH1,IH3,IH6)or normoxia exposure(N group).Quantificational real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of YAP. Western blot assay was used to detect the protein expression levels of YAP and P-YAP.ResultsThe mRNA expression levels of YAP were significantly increased with the increase of IH exposure time points in IH1(2.50±0.18),IH3(4.07±0.25) and IH6(9.18±0.58)groups than those in N group(1.00±0.01)(all P＜0.05).The protein expression levels of YAP were significantly increased with the increase of IH exposure time points in IH1,IH3 and IH6 groups than those in N group.The protein expression levels of P-YAP were significantly decreased with the increase of IH exposure time points in IH1,IH3 and IH6 groups than those in N group.ConclusionYAP cell signaling plays an important role in the process of OSAS-like IH induced tumor development.

sleep apnea,obstructive;cell hypoxia;A549 cell;YAP;P-YAP；qRT-PCR;Western blot

R734.2

A

10.11958/20161061

国家自然科学基金资助项目（81500070，81670084）；天津医科大学总医院青年孵育基金项目（ZYYFY2014011）

1天津医科大学总医院呼吸科（邮编300052）；2南开大学生命科学院

薛震（1988），男，硕士在读，主要从事阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与肿瘤相关研究

△通讯作者E-mail:tjcaojie@sina.com