CD73在卵巢上皮性癌组织中的表达及与肿瘤生长转移的相关性研究

马思宇，王瑛韬，狄 娜，王瑛坚*

(1.吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033;2.吉林大学中日联谊医院 药剂科)

CD73在卵巢上皮性癌组织中的表达及与肿瘤生长转移的相关性研究

马思宇1，王瑛韬2，狄 娜1，王瑛坚1*

(1.吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033;2.吉林大学中日联谊医院 药剂科)

目的 检测卵巢上皮性癌中CD73的表达情况及微血管计数值，探讨CD73与卵巢上皮性癌发生、发展、转移的关系。方法 利用免疫组化法及微血管计数法，检测正常卵巢组织，卵巢上皮性囊腺瘤，卵巢交界性上皮性囊腺瘤，卵巢上皮性囊腺癌中CD73的表达情况及微血管计数。分析卵巢上皮性癌中CD73表达程度及MVD计数与临床病理学参数的关系，并分析二者之间的关系。结果 卵巢上皮性癌组织中CD73的表达程度及MVD计数均高于良性组及交界组(P<0.05)，二者与患者年龄、组织学分型无关，与临床分期、组织学分级、淋巴结浸润、腹水及腹腔冲洗液中癌细胞相关，并且二者之间的表达正相关。结论 CD73在肿瘤的发生机制中起到一定的作用；CD73与恶性肿瘤严重程度正相关，有望作为一个新的评估卵巢上皮性癌病情进展及预后的指标，为基因的靶向治疗提供了新的思路。

卵巢上皮性癌；CD73；免疫组化；微血管密度

(ChinJLabDiagn,2016,20:2037)

CD73是一种跨膜糖蛋白，在生物体内参与胞外腺苷酸转化为腺苷的生物学过程，并且在这一过程中起到关键酶的作用[1]。近期研究发现，CD73在多种恶性肿瘤中高表达，在恶性肿瘤的形成、侵袭、转移中起重要作用。肿瘤能够在其转移部位的成功生长，有赖于肿瘤新生血管的供应作用。体外实验证实，微血管密度(MVD)是肿瘤样血管增生的定量指标，有报道指出在一些肿瘤中，MVD计数升高与肿瘤较差的预后存在着联系[2]。本实验旨在利用检测CD73的表达情况及MVD计数，探讨CD73在卵巢上皮性癌发生、发展中的作用机制，为卵巢上皮性癌的恶性程度的评价及预后评估提供一定的参考依据，以及能否通过抑制CD73的表达，为未来的基因靶向治疗提供一定的理论依据及新的靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取吉林大学中日联谊医院和长春市医院2014年1月至2015年12月间手术切除的组织标本，其中因其它疾病切除的正常卵巢组织20例、卵巢良性上皮性肿瘤组织20例、卵巢交界性上皮性肿瘤39例和卵巢上皮性癌组织84例。所有患者术前均未行放疗、化疗和激素治疗，亦未合并其他系统恶性肿瘤。患者年龄在32-77岁之间，平均年龄46.2±6.5岁；临床分期(FIGO.2013)，I-II期34例，III-IV期50例；组织学分级，G1 19例，G2 26例，G3 39例；组织学分型，浆液性58例，粘液性26例；有淋巴结转移者30例，无转移者54例；有36例患者的腹水或腹腔冲洗液中有癌细胞，48例未发现。

1.2 材料与方法

1.2.1 主要试剂 CD73(Mouse CD73 antibody)免疫组化染色试剂盒(艾博抗上海)；CD34(Mouse anti-CD34)免疫组化染色试剂组盒(北京中杉金桥)。

1.2.2 方法 所有选取标本均为新鲜取材，并立即于10%中性福尔马林溶液中固定，完成后经石蜡包埋、切片、免疫组化染色、HE染色。以试剂盒内已知的阳性切片为阳性对照，检测CD73的表达情况，同时应用CD34对肿瘤新生血管进行标记，进行微血管计数。

1.3 结果判定

1.3.1 CD73的结果判定 CD73阳性表达为：镜下在卵巢上皮细胞及肿瘤间质细胞胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒。切片评分采用综合评分法，①根据病变区域的普通染色强度记分：无着色或淡黄色，计为1分；细胞着色为棕黄色，计为2分；细胞明显着色为棕褐色，计为3分；②根据病变区域阳性细胞所占百分比记分：随机选取5个高倍视野，分别计数100个细胞，阳性细胞计数0%-10%为1分；10%-50%为2分；50%-100%为3分。以上两项评分相乘积为最终综合评分。评分1-3分判定为低表达；评分4分以上判定为高表达[3]，其中4分为强度I级，6分为强度II级，9分为强度III级。

1.3.2 MVD的判断标准 采用CD34标记微血管。血管内皮细胞胞浆着色为棕黄色，并且孤立或成团簇出现，只要其与临近微血管、肿瘤细胞或其它结缔组织分开，就把它们作为一个微血管。根据Weidner[4]计数方法，高倍镜下计数5个不同视野的微血管数，取平均值为间质微血管密度。单个着色的内皮细胞或者内皮细胞丛均按独立血管计数；管腔较大且有较厚肌层或管腔内有8个以上红细胞者，不在计数之列。

1.4 统计学方法

显著性检验采用χ2检验进行组间比较；各组间MVD计数均数比较用t检验处理；CD73表达情况与MVD计数的相关性用Spearman等级相关分析进行分析。结果以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 不同卵巢组织中的CD73表达情况及MVD计数

CD73在卵巢上皮性癌中的阳性表达程度及MVD计数值明显高于正常卵巢、良性和交界性上皮性卵巢肿瘤。提示CD73表达上调及肿瘤血管新生可能在卵巢上皮性癌的发生中起重要作用。(见表1)。

表1 在不同卵巢组织的中CD73的表达及MVD计数

注：比较CD73高表达率，正常组、良性组、交界性组3组间相互比较均无显著性差异(P>0.05)，此3组 与恶性组比较均有显著性差异(P<0.001)。各组间相互比较 MVD计数，P均<0.001，有统计学差异。

图1 CD73肿瘤上皮细胞典型及异质性染色 双盲评分4分(SP×400)高表达Ⅰ级 图2 CD73肿瘤上皮细胞膜典型着色双盲评分6分(SP×400)高表达Ⅱ级 图3 CD73肿瘤上皮细胞膜典型着色双盲评分9分(SP×400) 高表达Ⅲ级

2.2 卵巢上皮性癌组织中CD73的表达情况、MVD计数与临床病理学参数的关系

CD73阳性表达程度与MVD计数值与卵巢上皮性癌的多种病理学参数呈正向关系，临床分期越晚、组织分化程度越低、有淋巴结转移、腹水及腹腔冲洗液中有癌细胞者，CD73的阳性表达程度及MVD计数值越高。两者均与卵巢上皮性癌患者的年龄及病理学类型无关。(见表2)

表2 CD73阳性表达程度、MVD计数与临床病理学参数关系

2.3 卵巢上皮性癌组织中CD73的阳性表达情况与MVD计数的关系

在卵巢上皮性癌患者中，MVD与CD73的表达程度呈正相关(r=0.914，P<0.001)。(见表3)

表3 卵巢上皮性癌组织中CD73的阳性表达情况与MVD计数的关系

注：r=0.914，P<0.001

3 讨论

卵巢癌是女性最常见的致死性女性恶性生殖系统肿瘤之一，患者的5年生存率较低。随着近年来精准医学概念的提出，寻找基因水平的靶向治疗已成为研究的热点。CD73，又称胞外-5’-核苷酸酶，参与细胞的分子信号转导，发挥多种生物学作用[1]。CD73是具有酶活性的核苷酸，能够催化腺苷酸水解成为腺苷。生理状态下，小剂量的腺苷具有抑制细胞生长，诱导细胞凋亡的作用。近年研究发现CD73在多种恶性肿瘤中高表达，在恶性肿瘤的形成、侵袭、转移中起重要作用。肿瘤新生血管的形成对于肿瘤的新生、转移至关重要。MVD是肿瘤样血管增生的定量指标，有报道指出在一些肿瘤中，高表达的MVD与肿瘤较差的预后存在着联系。CD34能够在未成熟及内皮腔细胞内表达，标记肿瘤新生血管，CD34较其他因子具有更高的特异性及敏感性，是最有效指标[2]。

本研究发现，卵巢上皮性癌组织中CD73的表达程度及MVD计数均高于良性组及交界组(P<0.05)，二者与患者年龄、组织学分型无关，与临床分期、组织学分级、淋巴结浸润、腹水及腹腔冲洗液中癌细胞相关，并且二者之间的表达正相关。研究表明卵巢上皮性癌组织内普遍缺氧，而当组织处于缺血、缺氧的病理状态时，CD73表达上调[5]，导致腺苷生成增多，可以诱导癌细胞释放高水平的血管生成诱导因子，这些因子的增多可促进肿瘤血管的新生，诱导肿瘤的生长。还可以增加细胞的迁移、增殖和管腔形成的能力，有潜在的促进血管生成的作用。同时可以增加血管生成因子的旁分泌作用，直接作用于血管内皮细胞，诱导肿瘤血管的新生[6]。另外，CD73的酶活性可直接上调多种血管生成因子的表达，下调多种血管生成抑制因子的表达，破坏二者之间的平衡状态，直接促进肿瘤血管的新生。CD73同时具有非酶活性，可以直接参与影响炎症细胞与内皮细胞的黏附作用，淋巴细胞的转导过程，发挥促进免疫逃逸、免疫抑制的病理学功能。阻碍了机体对于肿瘤细胞的正常免疫应答，导致肿瘤的发生[5，6]。

国内外已有多项抑制CD73在恶性肿瘤中表达的体外实验，用CD73 单克隆抗体或多克隆抗体阻断小鼠乳腺癌细胞CD73的功能[16]，可显著抑制癌细胞生长及癌症的肺转移。肿瘤的分子靶向治疗相对于普通的化学药物治疗具有更高的特异性、安全性，然而适用于临床治疗的靶向药物少之又少，用CD73单克隆抗体或多克隆抗体技术、小干扰RNA技术来阻断CD73表达，使其功能缺失，对于肿瘤治疗至关重要，因此CD73有望成为基因治疗的新靶点，为基因靶向治疗提供新的思路，值得进一步研究[7]。

[1]Corbelini PF,Figueiró F,das Neves GM,et al.Insights into Ecto-5'-Nucleotidase as a New Target for Cancer Therapy:A Medicinal Chemistry Study[J].Curr Med Chem，2015 Apr 8.[Epub ahead of print]

[2]Gong X,Tong Q,Chen Z,et al.Microvascular density and vascular endothelial growth factor and osteopontin expression during the implantation window in a controlled ovarian hyperstimulation rat model[J].Exp Ther Med，2015，9(3):773.

[3]Masunaga R， Kohno H，Dhar DK，et al.Cyclooxygenase-2 expression correlates with tumor neovascularization and prognosis in human colorectal carcinoma patients[J].Clin Cancer Res，2000，6：4046.

[4]WeidernerN.Tumou ralvascularity as a prognostic factor in cancer patients:the evidence continues to grow [J].J Pathol,1998,184:119.

[5]Kerkel E,Laitinen A,R bin J,et al.Adenosinergic immunosuppression by human mesenchymal stromal cells (MSCs) requires co-operation with T cells[J/OL].Stem Cells,2016 Jan 5.doi:10.1002/stem.2280.[Epub ahead of print]

[6]Zukowska P,Kutryb-Zajac B,Toczek M,et al.The role of ecto-5'-nucleotidase in endothelial dysfunction and vascular pathologies[J].Pharmacol Rep,2015,67(4):675.

[7]Antonioli L,Yegutkin GG,Pacher P,et al.Anti-CD73 in cancer immunotherapy:awakening new opportunities[J].Trends Cancer,2016,2(2):95.

The expression of CD73 in epithelial ovarian tumor and relevant research of tumor growth and transfer

MASi-yu,WANGYing-tao,DINa,etal.

(China-JapanUnianHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective Researched the CD73 expresssion level and microvessel density in epithelial ovarian carcinoma tissues.And discuss the relationship between CD73 and the occurrence,development and transfer of epithelial ovarian cancer.Methods Using immunohistochemistry and microvessel counting method,detect expression of CD73 and microvessel count of normal ovarian tissues,ovarian cystadenoma,borderline ovarian cystadenoma,epithelial ovarian cystadenocarcinoma.Analysis the relationship between CD73 expression level and MVD with parameters and clinical pathology in ovarian epithelial carcinoma,and analyze the relationship between they two.Results In epithelial ovarian cancer tissues CD73 expression and MVD are higher than those in benign and borderline group (P< 0.05),independent of patients?age,histological type,but dependent of clinical stage,histological grade,lymph node metastasis and cancer cells in ascites and peritoneal flushing fluid,and CD73 expression and MVD are positively correlated.Conclusion CD73 plays a role in the pathogenesis of tumor.CD73 was positively correlated with the severity of malignancy,could be used as indicators of new assessment of disease progression and prognosis of ovarian epithelial cancer and new ideas of gene targeted therapy .

Epithelial ovarian carcinoma；CD73；Immunohistochemical stain；Microvessel density

吉林省科技发展计划项目(编号：20140414018GH)

1007-4287(2016)12-2037-04

R737.31

A

2016-03-04)

*通讯作者