APT5A1在大肠癌中的表达及意义

谢春英，徐雪松，杨照微，何成彦，黄丽红，王 海，周劲松

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

APT5A1在大肠癌中的表达及意义

谢春英，徐雪松，杨照微，何成彦*，黄丽红，王 海，周劲松

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

目的 探讨APT5A1蛋白在大肠癌及癌旁组织的表达及其意义。方法 应用液质联用技术对大肠癌及癌旁组织进行差异蛋白的分析检测，并用免疫印迹验证其准确性。结果 对差异蛋白点进行质谱鉴定，发现APT5A1蛋白在大肠癌组织中的表达水平低于癌旁组织，免疫印迹确认其准确性。结论 ATP5A1蛋白的低表达可能与大肠癌的癌变有密切的关系。

APT5A1蛋白；液质联用技术；大肠癌

(ChinJLabDiagn,2016,20:1979)

大肠癌(CRC)是最常见的消化系统的肿瘤，已经成为全世界医疗保健的问题[1]。有专家预测，结直肠癌的发病率和死亡率在我国今后很长一段时间内将稳步上升，成为我国发病率上升最快的恶性肿瘤之一[2]。因其恶性程度高，容易发生淋巴道及血道转移，就诊时已经有15%-35%的患者发生转移，丧失了手术治疗的最佳时机[3],而早期无淋巴转移者术后五年生存率却可达90%[4]。所以大肠癌的早期治疗能明显改善患者的生存率，早发现、早诊断、早治疗一直是大肠癌研究的热点。大肠癌早期诊断指标的寻找及其发病机制的研究一直是国内外学者们关注的问题。外国学者研究发现ATP5A1基因与结直肠癌的发病有关，但主要是在基因水平上探讨肿瘤发生的可能机制，而对ATP5A1蛋白质水平上的研究比较少，所以本研究采用蛋白质组学技术来探索ATP5A1蛋白在大肠癌及癌旁组织的表达情况。

1 材料与方法

1．1 组织来源

本实验所用组织标本均经病理学检查证实为大肠癌腺癌，癌旁组织标本均取自癌组织边缘上端10 cm外处的正常组织，取材前患者未经任何治疗。在上述标准下，收集吉林大学中日联谊医院经外科手术治疗切除的大肠癌及配对的癌旁组织标本18例，生理盐水即时冲洗干净，放置-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

二硫苏糖醇(DTT),TMED,碘乙酰胺(IAA),十二烷基硫酸钠(SDS)均购于美国GE公司，DNA酶，RNA酶，胰蛋白酶(测序级)，考马斯亮蓝-G250、苯甲基磺酰氟 (PMSF)购于美国Sigma公司，蛋白质定量试剂盒，尿素购自Bio-Rad公司，纳升级毛细管高效液相色谱-电喷雾离子肼质谱仪为美国Thermo Fisher公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 提取组织蛋白及测定蛋白质浓度 取50 mg组织充分研磨制成匀浆，低温离心留取上清备用。考马斯亮蓝染色,于595 nm处检测蛋白吸光度，根据标准品蛋白含量及吸光度绘制标准曲线，分析组织中的蛋白质浓度。

1.3.2 组织蛋白水解制备多肽混合物 将提取的组织蛋白用一定浓度的NH4HCO3溶解稀释，以降低组织蛋白中的尿素浓度。用DTT调定其终浓度至20 mmol/L,56℃避光放置1 h,还原蛋白质中被氧化失活的-SH基团。将反应体系降至室温，加入1M的IAA混匀后调定其终浓度为50 mmol/L,避光反应30 min。按照1∶50(胰酶：蛋白质)的比例向反应体系中加入测序级的胰酶，37 ℃酶切水浴孵育过夜。酶切样品分装，-80 ℃保存备用。

1.3.3 二维色谱与质谱联用鉴定蛋白质组成及数据库检索分析 用Buffer A溶液将样品溶解，各取50 μg的样品进行色谱上样，样品先进入低流速柱然后再经高流速柱进行洗脱。将洗脱的多肽用LTQXL离子肼质谱仪进行检测，选择合适的核质比检测范围，数据依赖方式二级全扫描。应用Thermo Fisher公司的Bioworks3.3.1SP1 软件，使用SEQUEST算法在数据库进行质谱数据的检索，寻找与其匹配的蛋白质和多肽，从而鉴定出相关的差异蛋白。

1.3.4 免疫印迹确证试验 对选定的目标蛋白ATP5A1进行免疫印迹试验，进一步的验证该蛋白的在大肠癌及癌旁组织的表达情况。ATP5A1单克隆抗体购自的美国Abgent公司，内参抗体为β-Actin。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 组织蛋白酶解产物的二维色谱与质谱联用分析

本研究采用谱图数来评价两组样品中同一个蛋白质的丰度，对于丰度发生变化的蛋白质，谱图数需要满足以下条件：(1)两个样品中谱图数的比值大于等于1；(2)两个样品中谱图数的差值大于等于72。通过具有统计学意义(每组至少做三次检测)的比较分析，得到大肠癌与癌旁组织的差异蛋白44个，在癌组织中表达上调的蛋白质21个，下调蛋白23个，目标下调表达蛋白ATP5A1的质谱图见图1。

图1 ATP5A1的质谱图

2.2 免疫印迹验证ATP5A1在大肠癌组织与癌旁组织的表达情况

用Western blot检测大肠癌及癌旁组织中ATP5A1蛋白的表达情况。结果表明ATP5A1蛋白在大肠癌中的表达水平明显低于配对的癌旁组织，此结果进一步的验证了二维色谱与质谱联用鉴定差异蛋白ATP5A1的准确性。结果见图2。

图2 ATP5A1的免疫印迹图

3 讨论

大肠癌的发生发展是一个复杂的生物学过程，在这一过程中必然伴随着蛋白质的变化。蛋白质组学技术已经成为大肠癌研究中重要工具，可以高通量、大规模的分析肿瘤组织蛋白与正常组织蛋白，发现蛋白质在表达量上的差异，从而筛选出与肿瘤发生发展密切相关的蛋白质，而这种蛋白质则可能成为肿瘤早期诊断的新的生物学标志物[5]。

ATP5A1基因编码ATP合酶的α-亚基，而ATP合酶则是位于线粒体上由16个蛋白质亚基组成的多亚基复合体，参与氧化磷酸化中ATP的合成和分解，而其α-亚基主要是参与质子的传递。ATP5A1基因位于人类的第18号染色体上，有研究证实该基因的失活会导致ATP合酶复合体的失活，从而促进细胞凋亡。Warburg假说认为，癌组织细胞由于线粒体功能受损，导致糖酵解的速率增加。之后该假说被不同类型的肿瘤证实了其正确性。有研究证实，在结肠癌中已经检测到了ATP5A1的低表达，然而这种低表达可能有助于结肠癌细胞获得对5-氟尿嘧啶的抵抗力[6]。而且ATP5A1基因的缺失与结直肠癌的低存活率相关，ATP5A1基因的低表达可能是临床结直肠癌不良预后的一个生物标志[7]。根据大肠癌遗传学发病机制将大肠癌分为两类，染色体不稳定性型(CIN)和微卫星不稳定型(MSI)，ATP5A1基因在CIN中的表达水平高于MSI中的表达水平，而这种低表达的ATP5A1可能会促进MSI型肿瘤的发展[8]。所以ATP5A1蛋白的低表达可能对大肠癌肿瘤的分型和及预测患者的预后中会有一定的指向作用。

目前关于ATP5A1蛋白在恶性肿瘤中的研究不多，张景萍[9]等使用二维凝胶电泳和质谱联用技术检测到了ATP5A1蛋白在食管癌中的上调表达，

林河春[10]等使用iTRAQ技术发现ATP5A1在高转移肺腺癌细胞中的表达水平低于低转移的肺腺癌细胞，提示ATP5A1蛋白的低表达可能跟肿瘤的转移有关，梁燕[11]等发现差异蛋白ATP5A1在鼻咽癌中也表达，可能成为鼻咽癌放射治疗的靶点。尽管在不同的肿瘤中ATP5A1的表达情况有一定的差异，但都说明了ATP5A1蛋白在肿瘤的发生发展中有一定的提示作用。本研究采用液质联用及蛋白质印迹技术阐明了ATP5A1蛋白在大肠癌及癌旁组织的表达情况，证实了癌旁组织中的表达的ATP5A1蛋白量明显高于大肠癌组织，提示在癌变组织ATP5A1可能扮演了癌症抑制因子的角色。由于蛋白质检测的方便和稳定性，所以ATP5A1蛋白可能会成为大肠癌早期诊断的新的分子标志物，但是究竟能不能应用于临床还需要进一步的研究。

[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2008[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2008,58:71.

[2]赵丽中，王宏磊.大肠癌早期诊断研究进展[J].中国肿瘤,2014,23(2):103.

[3]增德妙，陈嘉勇.大肠癌转移相关肿瘤标志物的研究进展[J].医学综述，2012,17(1)：88.

[4]Cancer Facts & Figures 2011[R].The American Cancer Society.2011.

[5]万晶宏，贺福初.蛋白组技术的研究进展[J].科学通报，1999,44(5)：904.

[6]Baran AA,Silverman KA,Zeskand J,et al.Themodifier of Min2(Mom2)loucs:Embryonic lethality a mutation in the ATP5a1 gene suggests a novel mechanism of polyp suppression[J].Genome Res,2007,17(5):566.

[7]Manny D，Bacolod，Francis Barany.Gene Dysregulations Driven by Somatic Copy Number Aberrations-Biological and Clinical Implications in Colon Tumors[J].Journal of Molecular Diagnostics，2010,12(5):552.

[8]Seth R,Keeley J,Abu-Ali G,et al.The putative tumour modifier gene ATP5A1 is not mutated in human[J].J ClinPathol,2009 ,62(7):598.

[9]张景萍，李 卉，孙晓宏,等.ATP5a1基因在新疆哈萨克族食管癌中的表达分析[J].新疆医科大学学报,2015,38(7):828.

[10]河 春,张方琳,耿 沁,等.应用iTRAQ技术筛选高转移和低转移肺腺癌细胞中差异表达的膜蛋白[J].肿瘤,2013,33(2):150.

[11]梁 燕，侯华新.大黄素乙酰化产物对鼻咽癌细胞放射增敏的线粒体蛋白靶点研究[D].硕士论文，广西医科大学，2012.

Expression and Significance of ATP5A1 in Colorectal Cancer

XIEChun-ying,XUEXue-song,YANGZhao-wei,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the expression and significance of ATP5A1 in colorectal cancer tissue and tissue adjacent to carcinoma.Methods Two-dimensional chromatography and mass spectrometry method were applied to identifying the difference of protein expressed in colorectal cancer and carcinoma tissue adjacent,using western blot method to verify its accuracy.Results Dentifying the different protein spots,we found that ATP5A1 protein expressed significantly lower in colorectal cancer than that in the tissue adjacent to carcinoma,and then further confirmed its accuracy by western blot.Conclusion The decrease of ATP5A1 expression may be have a closely relationship with colorectal cancer.

APT5A1 ptotein;Two-dimensional chromatography and mass spectrometry;colorectal cancer

国家自然基金资助项目(81572082)；吉林省科技厅资助项目(2014041005GH，20140311092YY，20150101153，20150414015)

1007-4287(2016)12-1979-03

R735.3

A

2016-04-12)

*通讯作者