桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺癌中的差异表达蛋白分析①

蔡丽萍，孙燕双，王 琳，陈 元，方 煜

(中国人民解放军第82医院特诊科，江苏 淮安 223001)



桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺癌中的差异表达蛋白分析①

蔡丽萍，孙燕双，王 琳，陈 元，方 煜

(中国人民解放军第82医院特诊科，江苏 淮安 223001)

目的：对桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺癌中的高表达差异蛋白进行分析，探索桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺癌的发病机理、为寻找特异性肿瘤标志物提供有力依据。方法：采用多肽体外标记技术(即比较蛋白质组学的方法)，对桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺乳头状癌患者的癌组织和甲状腺滤泡性腺瘤以及桥本氏甲状腺炎腺体组织的蛋白提取物进行iTRAQ分析，并与正常甲状腺组织作为对照组。寻找四种组织中差异表达的蛋白质，并将差异性明显的蛋白进行数据检索，明确这些差异性明显的蛋白质的生物学特性，并进行验证。结果：通过对桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺癌组织、甲状腺腺瘤组织、桥本甲状腺炎组织、正常甲状腺组织的四组蛋白提取物的分析比较，比较所得差异蛋白质，进行重合分析，最后得出8种有较高差异的表达蛋白。分别是：K6PL_HUMAN，NUCB2_HUMAN，CNBP_HUMAN，UB2V2_HUMAN，RAB8A_HUMAN，APOA4_HUMAN，RPL13_HUMAN，TES_HUMAN。对iTRAQ结果进行western blotting验证，得出以上八种蛋白的验证结果，比较发现，RPL13在四种组织中表达差异最明显。结论：通过蛋白比对发现，在桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺乳头状癌的发生过程中有8种表达的蛋白有较高差异，而核糖体蛋白13(RPL13)在桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺乳头状癌组织中表达最明显，可能为桥本氏甲状腺炎背景下并发甲状腺癌的发生、发展相关性较大的蛋白质。

桥本氏甲状腺炎； 乳头状甲状腺癌； 滤泡性腺瘤

本研究旨在通过比较蛋白组学的方法寻找桥本氏甲状腺炎背景下合并乳头状癌的较特异性蛋白，以利于桥本氏甲状腺炎并发甲状腺癌的早期诊断，并为开发靶向诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料和组织标本：收集患者手术切除的病理组织，冻存管封存，标记、冷冻，选取病理结果为桥本氏甲状腺炎背景下的甲状腺乳头状癌、滤泡性腺瘤及桥本氏甲状腺炎组织及正常甲状腺组织的冻存管各一管。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂及仪器设备BSA标准品、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBS(pH7.4)、Amersham2-D Quant Kit(试剂盒)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES缓冲液)、磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、罗丹明标记山羊抗兔IgG、生物素、链亲和素、N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯、兔单克隆抗体RPL-13、各型号试管、1.5mLEP管、台式高速离心机、台式高速冷冻离心机、旋涡混合器、可见光分光光度计、蛋白质谱仪。

1.2.2 蛋白质的抽提及质谱

1.2.2.1 抽提方法：将组织剪切成细小碎片，每100mg组织加入1mL溶液A，1ul溶液B和5ul溶液C。用超声波将细胞破碎，每次持续30s，共3～4次，每次破碎的间隔时间为1min，破碎后置于冰快上快速冷却。4℃离心5min，取上清液。

1.2.2.2 酶解标记：所用试剂若非特殊标明，都是ITRAQ试剂盒(Applied Biosystem)，按照试剂盒操作方法严格操作，在室温下反应1h之后各加入3倍体积水，使标记试剂完全分解。

1.2.2.3 质谱鉴定：MS扫描范围(m/z)350～1250，累积时间0.25s。MSMS扫描范围(m/z)100～2000，扫描模式：HS高灵敏度模式，累积时间0.1s。IDA采集模式，一个MSI图谱选择20个最强的母离子进行串级扫描。

1.2.3 iTRAQ实验数据：使用美国生物系统提供的ProteinPilot软件(version4.0)，依据Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定以及蛋白定量。对鉴定出的差异蛋白选择Swiss-Prot人种属数据库(Release 2010_04，20331条序列)进行相关检索，使用Pro Group算法自动选择定量肽段来计算报告离子的峰强度，进行iTRAQ蛋白定量。

1.2.4 western blotting验证：对提取的差异蛋白进行验证。每组验证的例数均为3例。

2 结 果

2.1 通过这四组间的两两对比分析，比较四组组织所得出的差异蛋白质，进行重合分析，最后得出了有8种有较高差异的差异表达蛋白。分别是：K6PL_HUMAN，NUCB2_HUMAN，CNBP_HUMAN，UB2V2_HUMAN，RAB8A_HUMAN，APOA4_HUMAN，RL13_HUMAN，TES_HUMAN。ttest p是两组间组织蛋白质检测峰值进行t检验的p值，小于0.05表示差异具有统计学意义；ratio表示各组组织蛋白质表达的比例，小于1表示低表达，大于1表示高表达。见表1。

表1 iTRAQ定量分析四种组织的蛋白质的两两比较结果

2.2 通过对iTRAQ结果的western blotting验证，得出以上八种蛋白的验证结果，后比较发现RPL13在癌组织、良性腺瘤组织及正常组织中差异最明显。预测蛋白大小：ACTIN为42KD； RPL13为24KD。见图1、图2。

2.3 根据图片结果，我们采用灰度扫描的方法，确定每个样本的相对表达量，见表2。

表2 灰度扫描结果

图1 原始图片

图2 灰度图片

2.4 在Western blot实验中，甲状腺乳头状癌组织中RPL13蛋白表达大于滤泡性腺瘤组织，高于桥本组织及正常对照组织。见图3。

图3 RPL13灰度结果柱状图

3 讨 论

研究发现有桥本氏甲状腺炎的患者合并发生甲状腺癌的几率为正常人群的3倍。由于桥本氏甲状腺炎合并甲状腺结节大多呈多发，且病理分型具有多源性的特点，使得超声对部分良恶性结节的鉴别尚有不足之处[1]。尽管许多研究人员一直致力于探索早期正确诊断恶性肿瘤最有效的手段，虽然BRAF基因检测为甲状腺癌的诊断提供了有价值的参考，但必须进行细针穿刺细胞学检查[2]。又由于恶性肿瘤的发生涉及到多个基因，而当基因发生突变或者出现调控异常情况时，细胞内外蛋白质的一系列形状及构型均会有相应的变化[3]，从理论上讲通过观察蛋白质的系列动态变化应可以了解肿瘤在机体内引起的相应改变，从而应能筛选出可用于恶性肿瘤早期诊断的指标。本研究采用iTRAQ技术的方法，因其在提供蛋白质动态信息方面具有独特的能力和优越性，为肿瘤特异性标记物的检测提供了新的技术平台和思路。而iTRAQ技术是比较蛋白质组学技术方法，是一种多肽体外标记技术。通过比较蛋白质在不同生理病理过程中种类和数量等的不同变化，能寻找疾病发生过程中比较特异的蛋白质标记物。它与传统的大通量分析方法如二维电泳等相比，具有效率高，准确率高的优点，用于比较肿瘤与桥本氏甲状腺炎腺体等组织之间蛋白表达的差异，能够增加实验结果的准确性。本研究目的是比较桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺乳头状癌与桥本氏甲状腺炎组织、滤泡性腺瘤及正常腺体组织各组之间差异表达的蛋白质，希望能寻找到桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺乳头状癌的较特异表达蛋白，并验证其能否作为桥本氏甲状腺炎背景下甲状腺癌的较特异的肿瘤标记物。

本研究对四组不同组织的蛋白提取物进行iTRAQ分析，iTRAQ质谱结果的蛋白质鉴定和定量分析采用美国应用生物系统公司提供的ProteinPilot软件(Version4.0)，依据Paragon算法进行相关肽段以及蛋白鉴定，并依据可变剪接进行蛋白定量。为了减少假阳性比例，我们采用ProtScoreg1.3来制定蛋白质鉴定的最低标准：每个鉴定到的蛋白质必须符合95%的置信区间，而且只有同一个蛋白质同时检测到5个95%的置信区间符合的多肽片段才进行定量。另外，在结果数据中，软件会自动校正因混样不均匀所带来的误差。在iTRAQ的定量中，软件根据Pro Group计算方法自动选择符合标准的多肽片段进行定量，并计算得到报告峰值，通过t检验，计算p值确定各组间是否有统计学差异，同时通过峰值比例确定表达差异倍数。通过对桥本氏甲状腺炎背景下的甲状腺乳头状癌组织的蛋白提取物进行iTRAQ分析，并与滤泡性腺瘤及桥本氏甲状腺组织及正常甲状腺组织作对比。寻找四种组织中差异表达的蛋白，得出了8种有较高差异的表达蛋白，并将这8种差异蛋白的鉴定结果输入Swiss-port蛋白数据库检索，明确各蛋白功能。通过这种技术路线，寻找出甲状腺乳头状癌与其它组之间的差异表达蛋白质，经Western blot 技术进行验证后的结果分析表明RPL13蛋白在甲状腺癌组织组中的差异表达程度最高。

经蛋白功能检索能够发现，RPL13蛋白是一种核糖体蛋白，是核糖体的主要组成成分，它能够促进核糖核酸的折叠，能够使核糖体处于了有利于执行翻译功能的构想状态，从而提高了蛋白质合成的准确性。它参与了细胞增殖、分化和凋亡，以及基因的复制、转录和机体发育的调控等功能，同时越来越多的证据发现RPL13蛋白与正常细胞的恶性转化密切相关[4]，而据文献报道目前核糖体蛋白在胃肠道肿瘤研究中初露端倪，相信随着人们对核糖体蛋白在肿瘤发生发展中的作用的研究，RPL13蛋白可望作为协助诊断桥本氏甲状腺炎合并甲状腺癌、判断预后和疗效评价的一个重要指标，为后续作为甲状腺乳头状癌诊断及治疗的靶标提供前期重要的实验依据。

[1] 王建红，王正滨，房世宝,等.桥本甲状腺炎合并甲状腺乳头状癌的超声诊断价值[J].中国超声医学杂志，2010(11)，988～991.

[2] Koperek O，Komauth C，Capper D. Immunohistochemical Detection of the BRAF V600E-mutated Protein in Papillary[J].Thyroid Carcinoma American Journal Of Surgical Pathology，2012，36(10)：1578～1581.

[3] 曲利娟，丁彦青.蛋白质组学技术及其在肿瘤转移相关蛋白筛选中的应用[J].实用癌症杂志,2005;20(5):547～551.

[4] 王辉，刘伟利.核糖体蛋白基因表达与肿瘤的关系[J].生理科学进展,2007,38(4):376～379.

Analysis on Differential Expression Protein in Hashimoto’s Thyroiditis Complicated with Thyroid Cancer

CAILiping,SUNYanshuang,WANGLin,etal

(SpecialCareClinicinNo.82HospitalofLiberationArmy,JiangsuHuaian223001,China)

Objective: 【Abstract】Objective：To analyze the high expression differential protein in Hashioto’s thyroiditis complicated with thyroid cancer and explore the pathogenesis and provide basis for searching specific tumor marker. Method：Applying vitro labeling technique(method of comparative proteomics), protein extracts on Hashimoto's thyroiditis background patients with papillary thyroid carcinoma and follicular thyroid adenoma and Hashimoto's thyroiditis gland tissue was analyzed by iTRAQ. And the normal thyroid tissue were selected as the control group. The differential expression protein in four tissues were to be seeked. And the differential apparent protein were done with data retrieval. The biological characteristics of the differential apparent protein were identified and verified. Result：Through the analysis of four groups of protein extracts on Hashimoto's thyroiditis background of thyroid cancer, thyroid adenoma, Hashimoto's thyroiditis tissues and normal thyroid tissue comparison, and the protein extracts of thyroid cancer tissue obtained by the comparative analysis were coincided and analyzed. This paper achieved the differential protein and performs the superposition analysis, and finally got 8 kinds of differential expression protein with relatively high difference: K6PL_HUMAN, NUCB2_HUMAN, CNBP_HUMAN, UB2V2_HUMAN, RAB8A_HUMAN, APOA4_HUMAN, RPL13_HUMAN and TES_HUMAN. Through verifying the Western Blotting of iTRAQ result, it achieved the verification results of the above 8 kinds of proteins. Through the comparison, it turned out that RPL13 showed the most obvious expression difference among four tissues. Conclusion: Through the comparison on the protein, it showed that the protein with 8 kinds of expressions had relatively high difference during the occurrence of Hashioto’s thyroiditis complicated with papillary carcinoma. However, the ribosomal protein 13 (RPL13) showed the most obvious expression in Hashioto’s thyroiditis complicated with papillary thyroid carcinoma, which may be the protein greatly related to the occurrence and development of Hashioto’s thyroiditis complicated with thyroid cancer.

Hashioto’s thyroiditis; Papillary thyroid carcinoma; Follicular adenoma

① 【基金项目】江苏省淮安市科技计划项目，(编号：HAS2013013)

1006-6233(2016)12-1973-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.12.015