3种直接性染发剂染料的生物安全性研究

金淑芳，胡勇，孙各琴，王夏虹，黄玉敏，程镇烽，赵平,潘育方

(1.广东药科大学 医药化工学院，广东 中山 528458; 2.广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山 528458; 3.广东药科大学 食品科学学院，广东 中山 528458; 4.中山大学中山附属医院 检验中心，广东 中山 528400)



3种直接性染发剂染料的生物安全性研究

金淑芳1,2，胡勇3，孙各琴4，王夏虹1，黄玉敏1，程镇烽1，赵平1,2,潘育方1,2

(1.广东药科大学 医药化工学院，广东 中山 528458; 2.广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山 528458; 3.广东药科大学 食品科学学院，广东 中山 528458; 4.中山大学中山附属医院 检验中心，广东 中山 528400)

目的 探讨藏红T、碱性品红和碱性蓝26这3种直接性染发剂染料对人体健康和人类居住环境是否存在潜在毒性。方法 采用透皮吸收、红细胞溶血、大肠埃希菌毒性测试、NIH/3T3细胞抑制率研究毒性情况，光谱学方法配合分子模拟方法研究其与生物大分子牛血清白蛋白的相互作用情况。 结果 在我国2015年《化妆品卫生规范》允许的浓度下，藏红T与碱性品红在48 h后的透皮吸收分别达到0.023 mmol/L和0.010 mmol/L。3种染发剂将导致红细胞溶血(LD50达到0.16～0.23 mmol/L)、抑制大肠埃希菌(LD50达到0.64～3.77 μmol/L)和NIH/3T3细胞的存活率(LD50达到2.32～22.77 μmol/L)，并与牛血清白蛋白细胞内生物大分子有较强的相互作用。 结论 这3种直接性染发剂对人类的健康和居住环境有潜在性威胁。

直接性染发剂； 溶血效应； 毒性效应； 牛血清白蛋白

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528458,China；2.GuangdongCosmeticsEngineering&TechnologyResearchCenter,Zhongshan528458,China； 3.SchoolofFoodandScience,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528458,China； 4.DepartmentofExaminationMedicalCenter,ZhongshanAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan528400,China)

直接性染发剂是可以直接使用、剂型使用范围广并适合家庭使用的一类染发剂。一直以来，直接性染发剂与癌症是否存在密切的联系一直备受争议[1-5]。流行病学认为，由于许多直接性染料裂分后可能形成毒性芳香族化合物，使用直接性染发剂可能会引起癌症或者不良反应[6-7]，但目前这方面的理论研究还很不充分[8]。与此同时，欧盟第七次化妆品规程修订案也颁发了禁止动物体内的遗传毒性测试[9]，寻找针对化妆品原料的新的体外毒性安全性测试方法也成为亟待解决的问题。

碱性品红(FB)、碱性蓝26(VBB)和藏红T(BR2)是在直接性染发剂中广泛使用的3种染料(结构见图1)[10-11]。本文在2015年《化妆品卫生规范》允许使用的剂量下，分别对这3种染料进行了透皮吸收、溶血效应、大肠埃希菌(E.coli)和小鼠纤维母细胞(NIH/3T3)的毒性效应的研究。其中，NIH/3T3细胞属于小鼠胚胎成纤维细胞系，已被运用于药物对人类皮肤的毒性研究[12-13]，尽管如此，但尚无分子水平上的相关研究报道。为了更好地研究这些染料的细胞毒性，本文在分子水平上对这些染料与生物大分子牛血清白蛋白(BSA)进行了光谱试验和理论模拟研究。

图1 3种染料染发颜色及分子结构式

Figure 1 The hair colors and molecular structures of three direct hair dyes

1 材料与方法

1.1 材料

牛血清白蛋白(BSA)购于上海生物工程有限公司；所有的染料购买于北京耦合科技有限公司；大肠埃希菌菌株E.coli( MTCC 1678)用作野生菌株；新鲜人体血液样品由中山市人民医院提供；PBS(pH 7.4)缓冲液是由10 mmol/L K2HPO4/KH2PO4,40 mmol/L KCl,100 mmol/L NaCl组成；猪的透皮吸收通过体外扩散池进行测试，猪腹部皮毛用电剪刀轻轻刮去以免造成损伤；紫外光谱通过日立U-3900H紫外分光光度计测试；荧光光谱在室温下通过PerkinElmer L55荧光分光光度计测试；细胞活力通过酶标仪(model 680,Bio-Rad,USA)测试。

1.2 方法

1.2.1 透皮吸收试验 采用离体的猪腹部皮肤，通过自行设计的流通池(图2)对透皮吸收情况进行实时性检测，透皮面积为0.64 cm2。在2015年版《化妆品卫生规范》中染发剂染料碱性品红的最大使用浓度为0.3%，与氧化物共同使用时最大允许使用量为0.15%；碱性蓝26的最大允许使用量为5%，与氧化物共同使用时最大允许使用量为0.25%；藏红T是最近几年新出现的一种新型染发染料，依据以上2种染料考虑，考察的最大允许使用浓度为0.4%，与氧化物共同使用时最大允许使用量为0.2%。所有测试每8 h取样1次。紫外分光光度计测试吸收的染料吸光度。

1.2.2 染发剂染料的溶血效应 健康成人血样由病理中心收集在抗凝血管中，5 000 r/min离心5 min，移除血清和血浆，然后在37 ℃下将不同浓度的染料与人类红细胞(RBC)样品(用PBS制成质量分数为10%)混合培养30 min。0.1%Triton X-100作为阳性对照。培养一段时间后，红细胞样品在5 000 r/min下离心10 min，取上层清液在540 nm进行紫外测试。溶血率按“溶血率= [At-Ac/A100%-Ac]×100%)”计算，式中：At是红细胞与染料相互作用后的上层清液吸光度；Ac是PBS上层清液的吸光度；A100%是0.1%Triton X-100与红细胞相互作用后引起红细胞全部破裂的上层清液吸光度。

Origin 8.0软件处理不同染料浓度下的溶血率数据得到染料的LD50值。

1.2.3 染料在大肠埃希菌上的毒性效应 用接种环将储存在琼脂糖培养基上的大肠埃希菌菌种(储存温度为4 ℃)接种在新鲜的液体培养基上，37 ℃过夜培养进行菌株活化，过夜增长的菌株在37 ℃新鲜的培养基上再次进行培养。将相同的大肠埃希菌浓度(1×105个)在不同的试管里培养并让其增长2 h直到进入对数期生长。现配的不同浓度染料溶液分别加入到处于对数期的大肠埃希菌中，并在相同的条件下进一步培养30 min。然后按不同的浓度倒平板，在37 ℃下培养24 h。完成培养后，计算菌落数。染料抑制率通过没有加入染料的大肠埃希菌进行估算。

1.2.4 细胞活力的测试 采用噻唑蓝(MTT)法测试细胞活力。将NIH/3T3细胞依每孔6×103个细胞接种于96孔板。过夜培养移除培养液，将包含不同浓度(6～100 μmol/L)的染料和培养基的混合液共200 μL添加入96孔板培养48 h。在培养到44 h时，将96孔板里每一个孔用PBS溶液(pH 7.4)冲洗3遍，并加入质量浓度为0.5 g/L的MTT溶液100 μL进行培养。4 h后移除，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL溶解活细胞里的甲瓒结晶。摇床溶解10 min后，在酶标仪490 nm处测试吸收。引起50%细胞死亡的对应的浓度为半数抑制浓度(LD50)。所有的试验平行做3次。

1.2.5 光谱试验 紫外吸收光谱和荧光光谱的滴定都是采取逐步滴加的方式。每一次在测试前整个反应系统在室温下放置5 min，以便于充分反应。

1.2.6 分子模拟 分子模拟的对接模式在AutoDock(在http://autodock.scripps.edu/下载的)上进行。BSA(BSA的ID: 3V03)的三维结构在http://www.rcsb.org/pdb/下载。染料三维结构在Discovery Studio 4.5 Client软件上完成。BSA在中心盒子上的x-,y-,z-的设置分别为12.6、12.6、12.6 nm。

2 结果与讨论

2.1 透皮吸收试验

皮肤是消费者和美发从业人员第一层也是最重要的保护层。皮肤对大多数染发剂都有潜在的吸收[14]。从3种染料的透皮吸收试验结果(见图2)可见，48 h后，藏红T的透皮浓度达到0.023 mmol/L，并且随着作用时间延长，透皮吸收浓度逐渐升高。另外，相比之下，藏红T比碱性品红和碱性蓝26具有更高的透皮吸收浓度，更易透过皮肤，说明藏红T不是理想的染发剂染料。而在同等的条件下，碱性蓝26的经皮吸收率均比藏红T和碱性品红低。

这3种染料的不同的经皮吸收效率可以通过它们的分子结构进行解释。众所周知，皮肤膜是非极性的，但是它的液体间隙是极性的，因此染料的不同结构在经皮吸收的过程中起了重要的作用[15]。碱性蓝26比藏红T和碱性品红有更多的苯环结构，结构刚性更强，可能导致碱性蓝26更多地积累在皮肤表层而非穿过皮肤。而藏红T拥有对称结构使它可能拥有更均衡的油水分配系数，因此穿过皮肤可能就更加容易。

图2 3种染料的经皮吸收试验结果

Figure 2 Results of the percutaneous absorption of three hair dyes

2.2 染料的溶血毒性和细菌毒性效应

染料的经皮吸收有可能会导致红细胞破裂和细胞质溶出[12]。因此，本文进一步测试藏红T、碱性品红和碱性蓝26对人体红细胞的溶血情况，结果见表1。可见，碱性蓝26比碱性品红和藏红T具有更高的溶血率。从染料剂量-溶血率关系(图3)可见，红细胞溶血率与染料的浓度呈剂量依赖性。

染料在染发过程中只有很少量进入了发干，大部分是以各种方式排放在环境中，因此可能会导致水资源、土壤肥力、水生生物等污染，这将最终以食物链的方式影响到人类的健康。为了评估这些染料对环境的损伤程度，本文用E.coli细菌对染料进行毒性评估研究，结果见表1和图3。可见，3种不同的染料都在相对较低浓度时对E.coli的活力造成较大的影响，并且随着染料浓度增高，E.coli活力降低越明显，碱性品红和碱性蓝26比藏红T有更低的LD50，表示它们对环境的危害比藏红T更强[8]。

2.3 染料的细胞毒性

上述试验证实，藏红T、碱性蓝26和碱性品红这3种直接性染料能够透皮吸收，且对红细胞具有不同程度的溶血率，对人体造成损害。为进一步研究它们对人体的损伤机制，本文选用公认对人体安全无害的姜黄素(CMM)染料作为阳性对照，研究3种染料对胚胎成纤维细胞NIH/3T3系统的毒性效应，结果见图4。可见，加入藏红T、碱性蓝26和碱性品红后，NIH/3T3的细胞形态均有明显的改变，大部分黏附细胞随着染料作用时间的延长，开始趋于变圆变亮并且开始漂浮于细胞培养液，随着培养时间的延长，这种现象更加明显，表明细胞已经逐渐死亡；而加入姜黄素后，NIH/3T3的细胞形态几乎没有变化，说明3种直接性染料导致了细胞的死亡。

同时，研究发现，随着藏红T、碱性蓝26和碱性品红3种直接性染料与NIH/3T3细胞系统作用的浓度增加，细胞活力呈递减状态，剂量与活力的关系见图5，细胞毒性效应的半数致死量(LD50)见表1。可见，这3种直接性染料对于NIH/3T3细胞系统具有较强的细胞毒性，与皮肤直接接触可能会对皮肤产生损伤。同时，碱性品红表现出比藏红T和碱性蓝26更高的细胞毒性效应，表明含有碱性品红的染发剂可能具有比另外2种染发剂更大的健康威胁。

图3 不同浓度染料的红细胞溶血(A)和大肠埃希菌活力(B)测定结果

Figure 3 The hemolytic rate of human RBC (A) and cell viability ofE.Coli(B) under different concentrations of hair dyes

表1 3种染料的红细胞溶血、大肠埃希菌、NIH/3T3试验的LD50值和BSA结合参数

注：姜黄素(CMM)作为阴性对照。

图4 3种染料(浓度为5 μmol/L)在不同时间段对NIH/3T3细胞形态的影响

Figure 4 NIH/3T3 cell morphology after incubated with dyes for different time(5 μmol/L)

图5 不同浓度染料作用下NIH/3T3细胞活力的改变

Figure 5 NIH/3T3 cell viability under different concentrations of dyes

2.4 染料与BSA的相互作用

“2.1”项透皮试验结果表明，3种直接性染发剂染料可以不同程度的透过皮肤，进入血液。在血液血清中含有大量的血清白蛋白，而血清白蛋白又是身体里很多内源性和外源性化合物的运输者。因此，本文尝试在分子水平上对染料与血清白蛋白作用机制进行研究。

2.4.1 BSA与染料作用的电子吸收光谱变化 蛋白质与小分子物质发生相互作用形成一个新的复合物会造成蛋白质紫外光谱吸收的增加或者减少。从BSA随着碱性品红浓度变化的紫外光谱吸收情况(图6)来看，BSA在280 nm处有吸收峰，这是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)3种氨基酸的特征吸收峰，滴加染料后BSA的吸收峰发生了明显的变化[16]。出现这种现象的原因可能是染料与BSA结合后，芳香氨基酸的微环境发生了变化，疏水性增加导致BSA构象变得疏松和伸展，引起280 nm处特征峰的变化[17]。碱性蓝26和藏红T也发生了类似的现象，说明这些染料与蛋白质之间产生了相互作用。

0.80.60.40.20.0吸光度270280290300310λ/nm

注：c(BSA)=10 μmol/L；碱性品红(FB)的浓度从上至下依次为0、3.2×10-4、6.4×10-4、9.6×10-4、1.28×10-3、1.6×10-3、1.92×10-3、2.24×10-3、2.56×10-3、2.88×10-3、3.2×10-3mol/L；箭头的指向是碱性品红滴加入BSA后光谱发生变化的方向。

图6 不同浓度碱性品红作用下BSA的紫外吸收光谱

Figure 6 The absorption spectra of BSA under different concen-trations of fuchsin basic

2.4.2 BSA与染料作用的荧光光谱变化 碱性品红逐步滴加在BSA溶液后，染料与蛋白质结合的荧光变化情况见图7。可见，BSA的荧光发射光谱随着滴加碱性品红的浓度增大发生明显的淬灭，碱性蓝26和藏红T也发生相似的情况，说明小分子与蛋白质发生结合会引起荧光的淬灭[18]。由于荧光淬灭可能发生动态淬灭和静态淬灭，常用Stern-Volmer方程(式1)来分析淬灭的机制。

(1)

式中：F和F0分别代表存在和缺乏小分子时的荧光强度，Ksv、Kq、ζ0和[Q]分别表示Stern-Volmer常数、淬灭速率常数、蛋白质寿命常数和淬灭剂的浓度。

从表1可以看出，3种染料的Kq远大于生物大分子最大的动态淬灭常数2.0×1010[19]，说明它们与BSA发生的是静态淬灭而非动态淬灭。

式(1)常表示成式(2)来计算染料与BSA的结合常数Kb和独立结合位点n。

(2)

从3种染料与BSA的结合参数(表 1)可见，它们与BSA的结合位点都大约为1，说明只有1个结合位点。同时，碱性品红的结合常数要比碱性蓝26和藏红T高。

300350400450λ/nm荧光强度

注：c(BSA)=10 μmol/L；碱性品红(FB)的浓度从上至下依次为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、1×10-4、1.2×10-4、1.4×10-4、1.6×10-4、1.8×10-4、2×10-4mol/L；激发波长为280 nm，发射波长为340 nm；箭头的指向是碱性品红滴加入BSA后光谱发生变化的方向。

图7 BSA的荧光发射光谱随着碱性品红浓度增大发生的变化

Figure 7 The emission spectra of BSA under different concen-trations of fuchsin basic

2.4.3 BSA与染料作用的分子模拟 将以上荧光光谱和紫外光谱试验的结果用分子模拟计算进一步验证，BSA与3种染料结合的模拟计算结果见图8。

a.碱性品红； b.藏红T； c.碱性蓝26。

图8 3种染料与BSA结合最稳固的构象图

Figure 8 The most stable conformations of BSA binding with three dyes

可见，这些染料均进入了BSA结构内部(口袋区域)，与BSA紧密结合，形成了复合物。这是因为在BSA中，存在着多种疏水和亲水性氨基酸，它们可以通过氢键与染料紧密结合，如碱性品红的N1与BSA里His 145的NE2形成一个距离0.288 nm的氢键；碱性蓝26的N2、N3和N4与BSA里Lys499的NZ、Glu125的OE2、Leu115的O形成氢键。另外，BSA又与这些染料之间存在疏水键。碱性品红被Arg144、Tyr 137等氨基酸残基包围，最低结合能为-32.06 kJ/mol。碱性蓝26被Val481、Leu346、Trp213等氨基酸残基包围，最低结合能为-41.44 kJ/mol。藏红T被Pro415、Tyr496、Lys533等氨基酸残基包围，最低结合能为-32.86 kJ/mol。根据以上数据可以得出：3种染料与BSA都具有较稳定的结合构象和较低的结合能，表明BSA与这些染料发生了强烈的相互作用，这与上面光谱试验的结果一致。

3 结论

直接性染发剂是否对人类存在危害一直是备受争议的问题。本文采用透皮吸收、红细胞溶血、大肠埃希菌、NIH/3T3细胞活力试验替代动物试验，对3种直接性染料藏红T、碱性蓝26和碱性品红进行了生物安全性评估。结果表明，碱性品红与藏红T对皮肤有潜在的透皮吸收，这3种染料在2015年版《化妆品卫生规范》允许的浓度下对红细胞溶血、大肠埃希菌和NIH/3T3细胞都表现出了较强的毒性效应。光谱试验与理论模拟计算结果均表明，这3种染料在进入体内后，与血清蛋白有较强的相互作用。据此认为，这3种直接性染料可能会对人体和环境健康都有潜在的危险，使用时应对其安全性予以重视。

[1] TAI Shuyu,HSIEH Huimin,HUANG Shuping,et al. Hair dye use,regular exercise,and the risk and prognosis of prostate cancer: multicenter case-control and case-only studies [J]. BMC Cancer,2016,16(1):1-12.

[2] ZANONI T B,HUDARI F,MUNNIA A,et al. The oxidation of p-phenylenediamine,an ingredient used for permanent hair dyeing purposes,leads to the formation of hydroxyl radicals: oxidative stress and DNA damage in human immortalized keratinocytes [J]. Toxicol Lett,2015,239(3):194-204.

[3] IARC. Occupational exposures of hairdressers and barbersand personal use of hair colourants: vol 99[M]. World Health Organization,1993:521-646.

[4] de GROOT A C. Side-effects of henna and semi-permanent ‘black henna’ tattoos: a full review [J]. Contact Dermat,2013,69(1):1-25.

[5] HANSEN H S,JOHANSEN J D,THYSSEN J P,et al. Personal use of hair dyes and temporary black tattoos in Copenhagen hairdressers[J]. Ann Occup Hyg,2010,54(54):453-458.

[6] LIZIER T M,ZANONI T B,DE OLIVERIA D P,et al. Electrochemicalreduction as a powerful tool to highlight the possible formation of by-productsmore toxic than Sudan III dye [J]. Int J Electrochem Sci,2012,7(9):7784-7796.[7] LIU Hongling,CHEN Jiangning,JIANG Jie,et al. Cytotoxicity of HC Orangeno. 1 to L929 fibroblast cells [J]. Environ Toxicol Pharmacol,2008,26(3):309-314.

[8] ZANONI T B,TIAGO M,FAIAO-FLORES F,et al. Basic Red 51,a permitted semi-permanent hair dye,is cytotoxic to human skin cells: studies in monolayer and 3D skin model using human keratinocytes (HaCaT) [J]. Toxicol Lett,2014,227(2):139-149.[9] REACH (Registration Evaluation Authorisation). Regulation (EC) No. 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December [R]. 2006.

[10] PIÉRARD G E,GOFFIN V,PIÉRARD-FRANCHIMONT C. Corneosurfametry: a predictive assessment of the interaction of personal-care cleansing products with human stratum corneum [J]. Dermatology,1994,189(2):152-156.

[11] DIAMANTE C,BERGFELD W F,BELSITO D V,et al. Final report on the safety assessment of Basic Violet 1,Basic Violet 3,And Basic Violet 4 [J]. Int J Toxicol,2009,28(6 suppl 2):193S-204S.

[12] MAITI S,SASAMAL K,SINHA S S,et al. Analysis of cytotoxicity and genotoxicity onE.coli,human blood cells and Allium cepa suggests a greater toxic potential of hair dye[J]. Ecotoxicol Environ Saf,2016,124:248-254.[13] DESPOSITO D,CHOLLET C,TAVEAU C,et al. Improvement of skin wound healing in diabetic mice by kinin B2 receptor blockade [J]. Clin Sci (Lond),2015,130(1):45-56.

[14] GONDAL M A,MAGANDA Y W,DASTAGEER M A,et al. Detection of carcinogenic chromium in synthetic hair dyes using laser induced breakdown spectroscopy [J]. Appl Opt,2014,53(8):1636-1643.

[15] NOHYNEK G J,ANTIGNAC E,RE T,et al. Safety assessment of personal care products/cosmentics and their ingredients [J]. Toxicol Appl Pharmacol,2010,243(2):239-259.[16] SAYO O F,AUSTRIA T,TASHLEY M,et al. Determination of mercury (II) ion concentrations in human serum albumin using fluorescence spectroscopy and multivariate regression analysis [J]. Appl Spectrosc,2012,66(9):999-1004.[17] WANG Houchen,JIANG Xiaohui,ZHOU Limei. Interaction of NAEn-s-n gemini surfactants with bovine serum albumin: a structure-activity probe [J]. J Lumin,2013,134(3):138-147.

[18] ZHAO Ping,HUANG Jinwang,JI Liangnian. Cationic pyridinium porphyrins appending different peripheral substituents: spectroscopic studies on their interactions with bovine serum albumin [J]. Spectrochim Acta Part A,2012,88(88):130-136.

[19] ZANONI T B,HUDARI F,MUNNIA A,et al. The oxidation of p-phenylenediamine,an ingredient used for permanent hair dyeing purposes,leads to the formation of hydroxyl radicals: oxidative stress and DNA damage in human immortalized keratinocytes[J]. Toxicol Lett,2015,239(3):194-204.

(责任编辑：陈翔)

The bio-safety concerns and evaluation of three direct hair dyes

JIN Shufang1,2,HU Yong3,SUN Geqin4,WANG Xiahong1,HUANG Yumin1,CHENG Zhenfeng1,

ZHAO Ping1,2,PAN Yufang1,2

Objective To investigate the potential toxicity of three permitted temporary hair dyes,fuchsin basic,basic red 2 and victoria blue B to both the human health and the environment. Methods Skin percutaneous absorption,hemolytic on human red blood cells,cytotoxic effects to NIH/3T3 andE.Colicell lines were detected to evaluate the cytotoxicity. Meanwhile,the interactions of these dyes with albumin from bovine serum were investigated through spectral methods and molecular docking studies. Results Even under permitted concentrations in current Hygienic Standard for Cosmetics,basic red 2 and fuchsin basic had the potential absorption through the skin,with a penetration efficiency to 0.023 mmol/L and 0.010 mmol/L,respectively. Meanwhile,these temporary hair dyes had severe cytotoxicity on human red blood (with LD50from 0.16 mmol/L to 0.23 mmol/L),NIH/3T3 (with LD50from 0.64 μmol/L to 3.77 μmol/L) andE.Colicell lines (with LD50from 2.32 μmol/L to 22.77 μmol/L). Meanwhile,these dyes showed intense interactions with albumin from bovine serum molecules. Conclusion It is suggested that temporary hair dyes could pose risk to both the human health and the environment.

direct hair dyes; hemolytic effect; cytotoxic effects; Albumin from bovine serum

2016-09-07

广东省自然科学基金项目(2016A03031380);广东省高等学校优秀青年教师培养项目

金淑芳(1990—),女，2014级硕士研究生；通信作者:赵平(1982— ),女,博士,副教授,从事化妆品安全性评价研究,Email:zhaoping666@163.com。

时间：2016-11-28 15:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161128.1535.002.html

TQ658.34

A

1006-8783(2016)06-0717-07

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016090701