藤珠胃康颗粒含药血清对小鼠胃癌MFC细胞增殖和凋亡的影响

王金，王芳，王小平，白吉庆

(陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046)



药理学

藤珠胃康颗粒含药血清对小鼠胃癌MFC细胞增殖和凋亡的影响

王金，王芳，王小平，白吉庆

(陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046)

目的 研究藤珠胃康颗粒含药血清对小鼠胃癌MFC细胞增殖和凋亡的影响。方法 MFC细胞经不同浓度藤珠胃康颗粒含药血清处理后，采用MTT法检测藤珠胃康颗粒含药血清对细胞增殖的影响；采用倒置显微镜观察细胞形态变化；采用流式细胞仪及AnnexinV/PI染色的方法检测对细胞凋亡的影响。结果 与对照组比较，藤珠胃康颗粒含药血清中、高剂量组细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05)；显微镜下观察，贴壁细胞逐渐脱落、缩成圆形；与对照组比较，给药组细胞凋亡率均显著增高(P<0.05)，并呈现剂量依赖性。结论 藤珠胃康颗粒含药血清对小鼠胃癌MFC细胞增殖有抑制作用，并能诱导细胞凋亡。

藤珠胃康颗粒； 胃癌； MFC细胞； 增殖； 细胞凋亡

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，根据2015年全国肿瘤登记中心统计的数据显示，2012年胃癌发病率、死亡率分别位居我国恶性肿瘤的第2位、第3位[1]。早期胃癌治疗通常以手术为主，中晚期则以放疗、化疗、生物治疗及中医药治疗为主[2]，近年来研究发现，中医药治疗可以明显缓解临床症状、减轻放化疗毒副反应，提高生存质量[3]。藤珠胃康颗粒是从陕西省中老名医沈舒文教授临床常用方剂中筛选出来的，由藤梨根、珠子参、黄精、白术、三棱等五味药材组成，具有解毒抗癌、益气养阴之功效，临床应用多年，效果良好。为了进一步探讨其抗癌机制，本文采用MTT法和AnnexinV/PI双染法观察藤珠胃康颗粒含药血清对小鼠胃癌MFC细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠20只，体质量180～210 g，西安交通大学医学部实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK (陕)2012-003。

1.2 MFC细胞株

购自武汉博士德生物工程有限公司，批号：CX0211。

1.3 药物与试剂

藤珠胃康颗粒由实验室自制；RPMI-1640、标准胎牛血清、PBS漂洗液、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、二甲基亚砜(DMSO)均购自武汉博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶消化液、青链霉素混合液均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 主要仪器

CCL-170B-8型CO2培养箱(新加坡ESCO)、BDS200倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)、Elx808酶标仪(美国BioTek)、FC500流式细胞仪(美国 BeckMan)、KDC-40低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、CR22GⅡ高速冷冻离心机(日本日立)。

2 方法

2.1 藤珠胃康颗粒的制备

将藤梨根、三棱、黄精、白术四味药加10倍量水煎煮3次，每次1 h，滤过，合并煎液，减压浓缩成稠膏，减压干燥制成干膏粉备用；将珠子参10倍量50%(φ)乙醇提取1次，2 h，滤过，回收乙醇，浓缩成稠膏，减压干燥制成干膏粉备用。上述两种干粉，加入糊精和乳糖适量，混匀，用80%(φ)乙醇作润湿剂，湿法制粒，60 ℃干燥，即得。

2.2 含药血清的制备

将SD大鼠随机分为对照组(等量纯化水)、藤珠胃康颗粒低(4.3 g/kg)、中(8.6 g/kg)、高(17.2 g/kg)剂量组(以生药计)，分别相当于临床每日剂量的5倍、10倍、20倍。每日灌胃1次，连续6 d，于第6天灌胃1 h后，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，56 ℃灭活30 min，0.22 μm无菌滤膜过滤后分装，置-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 MTT法测定含药血清对MFC细胞增殖的影响

收集对数生长期的细胞，调整细胞密度为3×104个/mL，以100 μL/孔接种于96孔板中，在37 ℃、5%(φ)CO2培养箱中培养24 h后，吸弃原培养液，每孔加入100 μL 含10%藤珠胃康颗粒含药血清的RPMI-1640培养液，每组设5个复孔，同时设置对照孔。继续培养24 h后，吸弃原培养液，每孔加入100 μL 含10% MTT的RPMI-1640培养液，继续培养4 h后，吸弃孔中液体，每孔加入100 μL DMSO，轻微震荡使结晶全部溶解后，于酶标仪570 nm波长处测定A值，计算抑制率，结果重复3次。肿瘤细胞抑制率(%)=(1-实验组A/对照组A)。

2.4 形态学观察

收集对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×105个/mL，以1 mL/孔接种到6孔板，于37 ℃、5%CO2的环境中培养24 h后，消化，离心，加入不同浓度的含药血清，培养24 h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。

2.5 流式细胞检测细胞凋亡

收集不同浓度含药血清处理24 h的对数生长期的MFC细胞，调整细胞密度为5×105个/mL，取1 mL细胞悬液置1.5 mL无菌离心管中，1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液，加入1 mL预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液，重复此步骤2次，将细胞重悬于200 μL Binding Buffer中，加入10 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI(碘化丙锭)溶液，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，然后加入300 μL Binding Buffer，转入流式管上用流式细胞仪分析。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 藤珠胃康颗粒含药血清对MFC细胞增殖的影响

藤珠胃康颗粒含药血清作用于细胞24 h后，对MFC细胞的抑制作用随含药血清浓度的增加而增强。与对照组比较，低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；中、高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 藤珠胃康颗粒含药血清对MFC细胞增殖的影响

组别剂量/(g·kg-1)A值细胞增殖抑制率/%对照组-0.148±0.02-藤珠胃康颗粒 低剂量组4.30.116±0.0121.62±0.07 中剂量组8.60.106±0.0228.38±0.14* 高剂量组17.20.098±0.0133.78±0.07*

与对照组比较：*P<0.05。

3.2 形态学观察结果

对照组细胞培养24 h后，细胞生长旺盛，延展性较好，移动和增殖符合MFC胃癌细胞规律，呈现细胞堆积状态；随着含药血清浓度增加，细胞慢慢缩成圆形，成单个独立个体，生长慢慢趋于迟缓，说明藤珠胃康颗粒对MFC小鼠胃癌细胞生长有一定的抑制作用。见图1。

3.3 流式细胞仪测定细胞凋亡结果

藤珠胃康颗粒含药血清作用于细胞24 h后，与对照组(23.3%)比较，随着含药血清浓度的升高，细胞凋亡率显著增高(36.3%、45.4%、65.5%，P<0.05)，初步说明藤珠胃康颗粒含药血清可能会诱导小鼠胃癌MFC细胞发生凋亡。见图2。

A.空白对照组； B.藤珠胃康颗粒低剂量组； C.中剂量组；D.高剂量组。

图1 藤珠胃康颗粒含药血清对MFC细胞形态的影响(200×)

Figure 1 Effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the morphology of MFC cells (200×)

Annexin V

A.空白对照组； B.藤珠胃康颗粒低剂量组； C.中剂量组； D.高剂量组。

图2 藤珠胃康颗粒含药血清对MFC细胞凋亡的影响

Figure 2 Effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the apoptosis of MFC cells

4 讨论

肿瘤发生的实质是细胞周期调控的紊乱导致机体细胞无间断的进入细胞周期，失去自主凋亡能力、恶性增殖的结果。因此抑制肿瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的重要手段[4-5]。

MTT实验结果显示，藤珠胃康颗粒含药血清可以抑制胃癌细胞的增殖，与对照组比较，低剂量组吸光度值差异无统计学意义，含药血清对细胞的抑制作用不明显；中剂量组吸光度值显著降低，含药血清对细胞产生了抑制作用；高剂量组抑制作用明显增强，说明藤珠胃康颗粒含药血清对MFC细胞的抑制作用存在一定的浓度依赖性。由于在显微镜下观察，贴壁细胞逐渐脱落、缩成圆形，提示细胞可能发生了凋亡。进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示给药组细胞凋亡率高于对照组，且随着含药血清浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增高，提示藤珠胃康颗粒含药血清具有诱导细胞凋亡的作用。说明藤珠胃康颗粒含药血清可以通过诱导细胞凋亡的方式来达到减缓细胞增殖的目的，但对于其抑制细胞增殖是否有其他作用机制，则有待于进一步的研究。

凋亡是多基因参与调控、多种蛋白相互作用的极其复杂的过程[6]。目前调控肿瘤细胞凋亡的主要基因有Bcl-2基因家族、c-myc基因、p53基因、caspase家族等[7-8]。藤梨根作为方中君药，发挥主要抗肿瘤作用，近年来对其作用机制研究很多。申力等[9]研究发现，猕猴桃根多糖可通过下调Mcl-1、Bcl-2、Bcl-x1蛋白和上调Bax、Bak蛋白的表达诱导MFC细胞凋亡。宋文瑛等[10]发现，猕猴桃根多糖可通过激活p38途径，进而激活caspase-9和PARP，最终诱导SGC-7901细胞凋亡。白吉庆等[11]研究发现藤梨根提取物可抑制Bcl-2蛋白表达而促进SGC-7901细胞凋亡。本研究结果表明，藤珠胃康颗粒含药血清可以诱导MFC细胞凋亡，推测其可能是通过上述一个或多个作用途径联合完成的，但对于其具体的作用机制，还需进一步的深入研究。

[1] 陈万青，郑荣寿，张思维，等. 2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤，2016，25(1):1-8.

[2] 吴颉，葛信国.中晚期胃癌中医治疗进展[J].辽宁中医药大学学报，2013，15(1):214-216.

[3] 李鑫，卫蓉.中医中药治疗胃癌的研究进展[J].贵阳中医学院学报，2012，34(1):116-119.

[4] 尤琪，张卉宁，黎昆东，等.双氢青蒿素促胃癌细胞凋亡的作用[J].广东药学院学报,2016,31(4):1-4.

[5] 韦丽兰,莫书荣.红景天苷对人胃癌细胞SGC-7901抑瘤作用的体外实验研究[J].山东大学学报(医学版),2015,53(12):12-15.

[6] 李娜,高俊岩,刘敏.细胞凋亡和肿瘤的关系研究进展[J].当代医学,2009,15(16):13-14.

[7] 刘延祥,张学武. 中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[J]. 时珍国医国药,2007,18(7):1563-1565.

[8] 何莉莎,李枋霏,孙桂芝,等.中药诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究进展[J].河北中医,2014,36(2):309-312.

[9] 申力,张光霁,张广顺,等.猕猴桃多糖对前胃癌MFC细胞及其原位移植瘤细胞凋亡的影响[J].中草药,2014,45(5):673-678.

[10] 宋文瑛,许冠华,张光霁.猕猴桃根多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及p-p38表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2014,34(3):329-333.

[11] 白吉庆,王小平,叶峥嵘.藤梨根提取物对人胃癌SGC-7901细胞凋亡及Bcl-2的影响[J].陕西中医学院学报,2012,35(1):59-61.

(责任编辑：幸建华)

Effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the proliferation and apoptosis of murine gastric cancer MFC cells

WANG Jin,WANG Fang,WANG Xiaoping,BAI Jiqing

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China)

Objective To study the effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the proliferation and apoptosis of murine gastric cancer MFC cells. Methods MFC cells were treated with serum containing Tengzhu Weikang Granule at different concentrations. The proliferation of MFC cells was determined by MTT assay. Morphological changes of cells were observed by inverted microscope. The cell apoptosis was detected by flow cytometry and AnnexinV/PI. Results Compared with the control group,the inhibition rate of cell proliferation was obviously increased in the middle and high dose groups (P<0.05). MFC cells turned round and gradually fell off. Meantime,the apoptosis rate of MFC cells was significantly higher in drug-treated groups in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion Serum containing Tengzhu Weikang Granule can efficiently inhibits MFC cell proliferation and induces cell apoptosis.

Tengzhu Weikang Granule; gastric cancer; MFC cells; proliferation; apoptosis

2016-07-30

陕西省科技统筹创新工程计划项目(2012KTCL03-14)

王金(1990—)，女，2014级硕士研究生，研究方向为中药质量评价及新药开发，Email: 1324511646@qq.com；通信作者：王小平(1976—)，女，博士后，教授，硕士生导师，主要从事中药质量评价及新药开发，Email: wangxiaoping323@126.com。

时间：2016-11-29 11:06

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1106.007.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0733-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016073001