防癌茶方3种中药多糖及其复合多糖的抗氧化活性研究

杨柳，李胜友，黄宏靓

(广东药科大学 1.中药学院； 2.生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)



防癌茶方3种中药多糖及其复合多糖的抗氧化活性研究

杨柳1，李胜友2，黄宏靓2

(广东药科大学 1.中药学院； 2.生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

目的 提取枸杞多糖(LBP)、黄芪多糖(APS)、红枣多糖(ZJP)，混合制成复合多糖(PM)，研究3种多糖及复合多糖的抗氧化作用。方法 进行DPPH 自由基清除、超氧阴离子自由基清除、羟基自由基清除能力检测。建立H2O2氧化损伤的人正常肝细胞(L-O2)和人肝癌细胞(HepG2)模型，多糖与损伤细胞共孵育后使用MTT法检测细胞活力，评价多糖对细胞抗氧化损伤活性。H2O2氧化损伤L-O2和HepG2细胞后检测丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性。结果 4种多糖均具有一定的抗氧化活性，但弱于相同浓度的抗坏血酸(VC)。在H2O2氧化损伤的细胞模型中，复合多糖显示了在较低浓度即具有良好的保护作用，在质量浓度分别为80 μg/mL和160 μg/mL时，L-O2细胞和HepG2细胞存活率最高。4种多糖均能显著降低氧化损伤细胞的MDA水平，细胞SOD和GSH-Px活力均显著升高。结论 枸杞多糖、黄芪多糖、红枣多糖及其复合多糖均具有一定的抗氧化作用，较低浓度的复合多糖对氧化损伤的细胞有更好的保护作用。

多糖；复合多糖；抗氧化活性

中药活性多糖(polysacharide) 是一类结构复杂的高分子化合物，可清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，具有保护生物膜和延缓衰老等作用[1]。研究表明，多种中药多糖复合作用时，抗氧化效果比单种中药多糖更佳，药理作用呈现协同性[2]。肝脏是人体重要的代谢器官，活性氧自由基引发的氧化应激是多种肝病发病的共同病理生理基础,在各种慢性肝病的形成和发展过程中起重要作用[3]。因此，建立一种可靠的肝细胞损伤模型，有助于评价中药活性成分的抗氧化活性[4]。

由黄芪、枸杞、红枣组成的茶方是传统的防癌茶方，具有增强和调节免疫力之功效[5]。其中黄芪味甘性微温、益气固表、补气养血。枸杞味甘性平、补肾益精、补血安神。红枣味甘性温、补中益气、养血安神。实验室在前期不同种类中药多糖及其复方多糖的抗氧化研究基础上，按照传统防癌茶方的组成，选择了枸杞多糖(LBP)、黄芪多糖(APS,)、红枣多糖(ZJP)及前述3种多糖的复合多糖(PM)，进行体外抗氧化活性评价。同时，选择人正常肝细胞L-O2及人肝癌细胞HepG2这两种细胞模型进行抗氧化评价，比较单种中药多糖和复合多糖的抗氧化活性，为中药复合多糖的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞(产地：宁夏，批号：160801)、黄芪(产地：甘肃，批号：160801)、红枣(产地：新疆，批号：160701)均购自广州至信中药饮片有限公司，由广东药科大学中药学院严寒静教授鉴定分别为茄科植物枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实，豆科植物黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. Var. mongholicus (Bge.) Hsiao 的干燥根，鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill. 的干燥成熟果实；95%(φ)乙醇、三羟甲基氨基甲烷(广州化学试剂厂)；1,1-二苯-2-苦基肼(上海麦克林生化科技有限公司)；抗坏血酸VC(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：F1517002)；MTT(噻唑蓝)(Sigma 公司，批号：M7905)；丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(批号分别是041916160906、063216160808、042916160912，上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 仪器与设备

SB-1100旋转蒸发仪(日本EYELA)；SCIENTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2500紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；Multi-scan Mk 3酶标仪、Thermo 311 CO2细胞培养箱(美国Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制备 将待提取的枸杞、黄芪、红枣药材分别洗净、烘干、粉碎为粗粉。按一定料液比热水浸提，经离心、浓缩、醇沉、Sevage 法[6]除蛋白、透析3 d后，冷冻干燥得多糖样品。参照汪琢等[7]的方法提取LBP；参照郭会清等[8]的方法提取APS；参照李铭芳等[9]的方法提取ZJP。

1.3.2 复合多糖的制备 按上述制备的枸杞、黄芪、红枣多糖根据传统防癌茶方的质量配比黄芪∶红枣∶枸杞 (4∶3∶3)，构成复合多糖。

1.3.3 DPPH清除率测定 参照文献[10],制成质量浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的样品溶液和VC溶液，以VC作阳性对照。DPPH自由基清除率由式(1)计算：

(1)

(1)式中，Ac为DPPH乙醇溶液与蒸馏水混合吸光值；Aj为乙醇和多糖溶液的吸光值；Ai为DPPH乙醇溶液和多糖溶液的吸光值。

1.3.4 ·OH清除率测定 参照文献[11]，配制成如上样品溶液和VC溶液。羟自由基清除率由式(2)计算：

(2)

(2)式中，As为不同多糖质量浓度下的吸光值；Ac为不加水杨酸时提取液的吸光值,Ao为不加样品时提取液的吸光值。

1.3.5 对超氧阴离子自由基的清除率测定 参照文献[12],配制成如上样品溶液和VC溶液。清除超氧阴离子自由基的能力由式(3)计算：

(3)

(3)式中，Ai为样品溶液的吸光值，Ao为相同体积的蒸馏水代替样品溶液的吸光值。

1.3.6H2O2诱导细胞损伤模型的建立L-O2和HepG2细胞以1×104个/孔接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24h后，分别加入不同浓度H2O2溶液，放入培养箱反应4h后，用MTT法测定细胞存活率。实验设3个复孔，重复3次实验，按公式(4)计算细胞存活率。

(4)

1.3.7 多糖最佳保护浓度的筛选 同“1.3.6”项进行L-O2和HepG2细胞接种，设置正常对照组、H2O2损伤组、多糖保护组。正常对照组、H2O2损伤组在含10%(φ)的胎牛血清DMEM 培养液中培养，细胞多糖保护组分别加入终质量浓度为40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的LBP、APS、ZJP及PM培养液处理。24 h后，H2O2损伤组和多糖保护组均加入100 mL终浓度分别为5 μmol/L和50 μmol/L H2O2损伤4 h，正常组加入等量的培养液处理4 h。然后用MTT法测定，按公式(4)计算细胞存活率。

1.3.8 MDA含量测定、SOD和GSH-Px活力检测 设置对照组，H2O2损伤组和筛选出的4种最佳多糖保护浓度组，方法同“1.3.7”项，根据试剂盒说明书检测并计算MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力。

2 结果与分析

2.1 LBP、APS、ZJP、PM对DPPH自由基的清除率

如图1所示，4种多糖随着浓度的增加，对DPPH自由基的清除率先升高后降低，清除率均小于同浓度条件下的VC溶液。当PM质量浓度为0.2 mg/mL时，相较于其他多糖有较强的清除作用。质量浓度在0.4～1 mg/mL的LBP的清除率高于其他多糖组。可见4种多糖具有明显清除DPPH自由基的能力。

图1 4种多糖对DPPH自由基的清除作用(n=4)

Figure 1 Scavenging activities of four polysaccharides on DPPH radicals

2.2 LBP、APS、ZJP和PM对·OH自由基的清除率

图2显示，在所选范围内， LBP、ZJP和PM随着浓度的升高，对·OH自由基的清除率先升高后降低。APS随着浓度升高，清除·OH自由基能力不断增强。4种多糖对·OH自由基的清除率均小于同浓度条件下的VC溶液对·OH自由基的清除率。质量浓度在0.2～0.4 mg/mL时，ZJP对·OH自由基有较强的清除作用。质量浓度在0.6～0.8 mg/mL时， LBP有较强的清除作用。APS在质量浓度为1 mg/mL时清除·OH自由基能力最强。PM清除·OH自由基能力在0.4 mg/mL以上浓度显示相近活性。

图2 4种多糖对·OH自由基清除作用(n=4)

Figure 2 Scavenging activities of four polysaccharides on hydroxyl radicals

2.3 LBP、APS、ZJP和PM对O2-·自由基的清除率

图3显示，在所选范围内， LBP、ZJP和PM随着浓度的升高，清除O2-·自由基的能力先强后弱。APS随着浓度升高，清除O2-·自由基能力不断增强。4种多糖对O2-·自由基的清除率均小于同浓度条件下的VC溶液对O2-·自由基的清除率。质量浓度在0.2～0.6 mg/mL和1 mg/mL时， LBP清除作用最强。质量浓度在0.8 mg/mL时，PM清除能力最强。

Figure 3 Scavenging activities of four polysaccharides on superoxide anion radicals

2.4 多糖对L-O2和HepG2细胞最佳保护浓度筛选结果

浓度为5 μmol/L的H2O2作用于L-O2细胞4 h，细胞存活率为(40.4%±2.16)%,此时细胞出现一定损伤，选择此浓度的H2O2作用4 h建立L-O2细胞氧化损伤模型。如图4所示， LBP、APS、ZJP的最佳保护浓度分别为160、40、80 μg/mL。当PM质量浓度为80 μg/mL时，细胞存活率为86.9%，达到最高，说明较低浓度的PM即可达到对氧化损伤的L-O2细胞较强的保护作用。

图4 4种多糖对L-O2细胞的抗氧化作用(n=4)

Figure 4 Antioxidant activity of four polysaccharides in L-O2 cells

浓度为 50 μmol/L的H2O2作用于HepG2细胞4 h，细胞存活率为(51.9±1.89)%,选择此浓度的H2O2作用4 h建立HepG2细胞氧化损伤模型。由图5可知， LBP、APS、ZJP的最佳保护浓度分别为160、320、160 μg/mL。在质量浓度40～320 μg/mL的范围内，PM的细胞存活率明显高于其他多糖组。质量浓度为160 μg/mL时，细胞存活率为78.4%，达到最高，由此说明PM对氧化损伤的HepG2细胞在较低浓度即显示了较强的保护作用。

图5 4种多糖对HepG2细胞的保护作用(n=4)Figure 5 Antioxidant activity of four polysaccharides in HepG2 cells

2.5 体外细胞抗氧化指标检测

如表1、表2所示，H2O2损伤L-O2细胞、HepG2细胞,H2O2模型组与正常组相比，MDA 水平显著升高，SOD和GSH-Px活力显著降低。4种多糖保护组与模型组相比，均能显著降低两种细胞MDA水平，细胞的SOD和GSH-Px活力均显著升高。在L-O2细胞模型中，PM的SOD和GSH-Px活力达到最高值，比单种多糖抗氧化作用更明显。在HepG2细胞中，4种多糖的MDA水平和SOD活力接近，但PM的GSH-Px有明显活力，达到最高值。

表1 多糖对L-O2细胞中MDA含量、SOD和GSH-Px活性影响

与正常组比较：△P<0.05； 与模型组比较：*P<0.05。

表2 多糖对HepG2细胞中MDA 含量、SOD和GSH-Px活性影响

与正常组比较：△P<0.05； 与模型组比较：*P<0.05。

3 讨论

人类多种疾病与体内过剩氧自由基(ROS)有关[14]。研究者发现自由基反应与肿瘤的发生和发展过程密切相关,在复杂的癌变过程中,自由基可能起重要作用。中药多糖能够清除和平衡多种活性氧自由基，减少自由基对人体的损伤，与化学合成药品比较，中药多糖具有无毒、生物相容性良好等优点[15-16]。

在前期多种中药多糖抗氧化活性研究基础上，按照传统防癌茶方的组成，分别提取枸杞、黄芪和红枣的多糖成分，对单味中药多糖与复合中药多糖的抗氧化活性进行研究，结果表明4种多糖在清除DPPH自由基、·OH、O-2自由基等一系列检测中，显示了明显的抗氧化活性。进一步通过H2O2氧化损伤肝细胞模型评价多糖的抗氧化活性，结果显示，在正常肝细胞L-O2细胞和肝肿瘤细胞HepG2细胞氧化损伤模型中，PM浓度分别为80、160 μg/mL时，两种模型的细胞存活率达到最高，与其他单味多糖相比，低浓度的PM在正常肝细胞即表现出更强的抗氧化活性，同时4种多糖处理两种氧化损伤细胞后，细胞MDA下降，SOD和GSH-Px活力显著升高。因此推测多糖可能通过提高 SOD 和GSH-Px活性，降低MDA含量，减少氧化应激对细胞的损伤，从而发挥抗氧化作用[17]。

实验结果表明，防癌茶方PM在体外抗氧化活性略低于单种多糖，但在细胞模型抗氧化活性评价中在较低浓度即显示出较强的抗氧化能力，尤其在正常肝细胞中PM抗氧化活性更明显。上述结果提示PM被细胞摄取后有利于细胞抗氧化能力的提高，这为中药PM开发作为良好抗氧化活性物质提供一定的依据，但其抗氧化作用机制还有待在今后的动物实验中进一步验证。

[1] 龚涛，王晓辉，赵靓，等.枸杞多糖抗氧化作用的研究[J].生物技术，2010，20(1)：84-86.

[2] 谢好贵，韦明钎，陈美珍，等. 3种多糖复合体外抗肿瘤协同增效作用[J]. 食品科学,2013，34(15)：289-294.

[3] 赵辉，孟炜，易述红，等.体外L02 肝细胞氧化损伤模型的构建[J].器官移植，2014，5(4)：242-250.

[4] 金明，王玉娇，金梅花，等.两种细胞建立肝细胞氧化损伤模型比较[J].中国公共卫生，2015，31(3)：324-326.

[5] 马宝旭.“补药之长”黄芪的食疗应用[J].健身科学，2014，12(7): 37-39．

[6] 林翔凯，张龙涛，陈洁，等.紫薯多糖脱蛋白工艺的研究[J].热带作物学报，2014，35(2)：381-386.

[7] 汪琢，赵佳莹，廖林.枸杞多糖提取条件优化及体外抗氧化活性研究[J].湖北农业科学，2015，54(6)：1440-1444．

[8] 郭会清，于俊美，田勤.黄芪粗多糖提取工艺的优化[J].食品研究与开发，2015，36(21):78-80.

[9] 李铭芳，李淑芳，汪小强，等.红枣多糖提取及分离工艺研究[J].天津农业科学，2013，1(19)：40-42．

[10] NA R K，YA M A，GU C，et al. Antioxidative activity of water soluble polysaccharide in pumpkin fruits [J].Biosci Biotech Biochem，2009，73(6)：1416-1418.

[11] SONG H F，ZHANG Q B，ZHANG Z S，et al.Invitroantioxidant activity of polysaccharides extracted from Bryopsis plumosa [J]. Carbohydrate Polymers,2010，80(11)：1057-1061.

[12] BING J C，ME J S，SHUAI C，et al.Improved antioxidant and anti-tyrosinase activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme by degradation[J]. Inter J Biolog Macromol，2016，92(11)：715-722.

[13] LI J，NIE S，XIE M，LI C.Isolation and partial characterization of a neutral olysaccharide fromMoslachinensisMaximcvJiangxiangru and its antioxidant and immunomodulatory activities[J]. Functional Foods，2014，6(2)：410-418.

[14] 王德才，高丽君，高艳霞.泰山四叶参多糖体外抗氧化活性的研究[J].中国生化药物杂，2008，29(2)：104-106.

[15] 王婧杰，陈玉霞，穆立蔷.紫椴花多糖的微波提取及体外抗氧化活性[J].食品与生物技术学报，2014，33(3)：321-329．

[16] 彭钦.天然多糖体外抗氧化活性研究[D].天津：天津大学，2013.

[17] 甘伟发.茶枝柑皮提取物中多糖成分的分离纯化及抗氧化活性研究[D].广州：广东药学院，2013.

(责任编辑：幸建华)

Effect of three kinds of Chinese medicine polysaccharides and their compound polysaccharide on antioxidant activity

YANG Liu1,LI Shengyou2,HUANG Hongliang2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofBioscienceandBiopharmaceutical,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To study the antioxidant activity of polysaccharides from Lycium barbarum (LBP),Astragalus (APS),Ziziphus jujube (ZJP) and their compound polysaccharide (PM). Methods Antioxidant activity is evaluated by scavenging DPPH free radical,hydroxyl free radical and superoxide anion free radical. L-O2 cells (human normal liver cells) and HepG2 cells (human liver cancer cells) were damaged by H2O2,then the antioxidant activity of polysaccharides in L-O2 cells and HepG2 cells was detected by MTT assay. The levels of MDA,SOD and GSH-Px were detected. Results Four kinds of polysaccharides showed the antioxidant activity but lower than VCinvitro. The cell viability was the highest in L-O2 and HepG2 cells when treated with the compound polysaccharide at 80 μg/mL and 160 μg/mL,respectively. Four polysaccharides reduced MDA content and increased SOD and GSH-Px activities in cells. Conclusion LBP,APS,ZJP and PM show antioxidant activity,especially PM at the lower concentration,in cells when damaged by H2O2.

polysaccharide; the mixture of polysaccharide; antioxidant activity

2016-10-08

广东省教育厅优秀人才培育基金(2050205F5504)

杨柳(1990—)，女，2014级硕士研究生，从事中药活性成分研究，Email：2208954369@qq.com；通信作者：黄宏靓(1974—)，男，副教授，硕士生导师，主要从事生物技术药物研究，Email：hhongliang@163.com。

时间：2016-11-29 10:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1000.003.html

R285.5

A

1006-8783(2016)06-0752-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016100801