壳聚糖定量分析方法的研究进展

马彩娟，张伟爱，白研

(广东药科大学 公共卫生学院，广东 广州 510310)



综述

壳聚糖定量分析方法的研究进展

马彩娟，张伟爱，白研

(广东药科大学 公共卫生学院，广东 广州 510310)

壳聚糖(chitosan)是目前自然界唯一带阳离子的碱性多糖，具有减肥降脂、增强免疫力等生物活性，使其在医药和功能性食品领域都备受关注，因此，以壳聚糖为核心成分的产品质量控制是一个重要的研究课题。本文综述了近年来壳聚糖定量分析的主要方法，包括光谱法、电化学法和高效液相色谱法等，并对其分析测定的发展进行展望，旨在为各类产品中壳聚糖的定量分析提供新的思路。

壳聚糖； 定量分析； 光谱法； 电化学法； 高效液相色谱法

甲壳素属于天然多糖，广泛存在于低等生物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆虫的外壳中，是由N-乙酰氨基葡萄糖缩聚而成的线性聚合物[1]。甲壳素多聚糖不溶于水及弱酸、弱碱性物质，难以被人体吸收和利用。

1859年Rouget将甲壳素浸泡在高浓度KOH溶液中煮沸一段时间，取出后发现其可溶于有机酸中。1894年Hoppe-Seiler确认这种产物是脱掉部分乙酰基的甲壳素，并命名为壳聚糖(Chitosan)。所以，壳聚糖为甲壳素经过强碱水解或酶解等化学法脱乙酰基(脱去55%以上)后形成的产物，是以β-(1,4)糖苷键串联的氨基葡萄糖线性大分子，化学名称是聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖[2]，图1为甲壳素和壳聚糖的分子结构。壳聚糖天然无毒，具有生物相容性、生物降解性、易成膜性，属于可食性动物纤维，并可被人体利用[2]。目前，医学上已经证实壳聚糖的主要功能包括降血脂[3]、抗肿瘤[4]、增强细胞免疫功能[5]和抑菌作用[6]，而且，壳聚糖与机体组织具有亲和作用，不与体液起反应，也无抗原作用。因此，壳聚糖在医药和功能性食品中有着广泛的应用，其核心成分壳聚糖的准确含量是非常重要的质量指标。

壳聚糖为天然高分子，分子量和脱乙酰度为壳聚糖的两大物理特征指标，其分子量从数千到数百万不等，壳聚糖分子量越大，碳链越长，在弱酸条件下疏水性越强。一般而言，N-乙酰基脱去55%以上的就可称之为壳聚糖，而市面上壳聚糖保健产品的脱乙酰度通常在85%以上，壳聚糖的脱乙酰度越大，溶解性越好。不同的壳聚糖产品之间可能存在壳聚糖分子量和脱乙酰度的差异，因此，建立准确定量分析壳聚糖的方法，对保障产品质量稳定和可控，具有十分重要的意义。

图1 甲壳素(A)和壳聚糖(B)的结构

Figure 1 Structure of chitin (A) and chitosan (B)

由于壳聚糖本身具有分子量大、黏度大、溶解度较差、易于降解、且紫外吸收较弱等特点，对其准确定量仍存在一定的困难。本文就国内外文献报道的壳聚糖定量分析方法进行综述，旨在为各类样品中壳聚糖准确定量的深入研究提供思路。目前，定量分析方法主要集中在光谱分析法，另有少量电化学法和高效液相色谱法。

1 光谱分析法

1.1 分光光度法

分光光度法测定壳聚糖含量具有操作简单、方便、快速、经济，以及样品不需要特殊前处理的优点，该类方法应用于壳聚糖的分析研究相对较早，也是研究成果最多的方法之一。壳聚糖本身不具有发色基团，不能通过分光光度法直接检测，需要在弱酸性条件下，质子化的氨基与带负电荷的阴离子大分子(如酸性染料或者金属试剂)通过静电引力结合，体系吸光度的变化与壳聚糖的含量呈线性相关，从而定量测定壳聚糖的含量。早期使用茚三酮[7]及灿烂红3B-A[8]为显色剂，作为经典方法，后来进行了不少相关的优化研究[9-11]。近年来发展了更多基于大分子与壳聚糖结合的分光光度法，表1为近年来国内外采用分光光度法在定量测定壳聚糖的研究成果。试验中缓冲溶液的种类和加入量、pH值、试剂加入量、反应时间、稳定时间、温度和试剂加入顺序、离子强度等是建立方法的重要影响因素。

Mendelovits等[10]在Muzzarelli[8]实验的基础上对分光光度法进行了改进，使用了胶体法和离心法对壳聚糖定量，并将两种方法进行了对比。胶体法是通过测定壳聚糖与灿烂红3B-A的缔合物的吸光度值进行定量；离心法是通过离心除去两者形成的胶体沉淀，测定溶液中剩余的染料含量。研究发现胶体法在一定程度上会受到试剂空白的影响，但离心法可以避免染料的试剂空白对低浓度壳聚糖含量测定的影响，且线性较好。

表1 分光光度法测定壳聚糖

随着研究的深入，壳聚糖的脱乙酰度和分子量对壳聚糖含量测定的影响也逐渐被研究者关注。郑铁生等[12]在利用溴甲酚绿为探针的分光光度法中发现脱乙酰度越大，含量测定的结果越高。白研等[13]利用活性红4与壳聚糖形成的离子缔合物对壳聚糖含量进行测定，并研究了壳聚糖分子量对其准确定量的影响，通过对比低分子量标准溶液与中分子量标准溶液对结果的影响，推断出该测定方法不受分子量大小的影响，具有普遍适用性。尽管分光光度法操作简便、快速，但总体来说，该类方法灵敏度较低，选择性较差，部分金属元素对体系可能存在干扰，影响壳聚糖的准确定量。

1.2 荧光淬灭法

迄今为止，荧光光度法测定壳聚糖含量均采用荧光淬灭法，荧光淬灭法是一种比直接荧光测定法更灵敏、选择性更好的方法。该类方法是在弱酸性条件下，利用壳聚糖与带有发光基团的阴离子大分子结合，破坏荧光物质本有的刚性结构，使体系的荧光强度降低，且与壳聚糖的含量和荧光强度的降低程度呈线性关系，以此来定量分析壳聚糖含量。近年来基于荧光淬灭法对壳聚糖定量分析的研究成果也较多，见表2。

表2 荧光光度法测定壳聚糖

韩美娜等[25]研究了在NaH2PO4-Na2HPO4溶液中，壳聚糖对异硫氰酸的荧光淬灭作用，发现吐温-20对该体系有明显的增敏作用，将壳聚糖的测定方法从两元体系增加到三元体系。该方法干扰小，但线性范围较窄。张伟爱等[26]研究发现了壳聚糖对活性红4存在的荧光淬灭作用，激发波长和发射波长分别为λex/λem=285/341 nm，淬灭方式为动态淬灭，实验中同时发现了壳聚糖-活性红4缔合物在342 nm处有强烈的共振瑞利散射峰，散射强度随壳聚糖含量增加而增强，据此建立了以活性红4为探针的荧光淬灭法和共振瑞利散射法，方法灵敏度较高，并将两种不同的测定方法结果进行对比，应用于实际样品中，测定结果基本一致。总体来说，荧光淬灭法较分光光度法灵敏度高，方法稳定性较好，但仍存在选择性较差的问题，测定结果易受部分金属离子的影响。

1.3 共振瑞利散射法

共振瑞利散射法是一种高灵敏度的分析测试技术，始于20世纪90年代初，是指当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射，其散射强度比单纯的瑞利散射提高几个数量级，并且不再遵循瑞利定律[27]。2007年，杨季冬等[28]首次应用共振瑞利散射法用于壳聚糖的含量测定，探讨了壳聚糖与蛋白质在铜离子存在下的作用机理，发现Cu(Ⅱ)存在下，血清白蛋白与壳聚糖相互作用后RRS光谱强度剧增，同步荧光也发生变化。方法具有较高的灵敏度，可用于保健胶囊中壳聚糖测定。王玉微[29-30]应用共振瑞利散射技术研究了壳聚糖分别与阴离子表面活性剂、染料分子(刚果红、曲利本蓝、茜素红)、金属铈和金纳米之间的相互作用，定量检测壳聚糖的含量，结果令人满意。

近年来，共振瑞利散射法因其操作简便、灵敏度高、选择性好的优点受到广泛的关注并已成功运用到多个领域，是分析化学领域中一重要的分析技术，而利用共振瑞利散射法对壳聚糖的定量分析也有了新的进展。Zhang等[31-32]分别建立了以萘酚绿B和水溶性苯胺蓝为探针的共振瑞利散射法，方法灵敏度高，准确性好。通过统计学分析，结果表明，两个体系中壳聚糖的准确定量不受分子量的影响，同时水溶性苯胺蓝-壳聚糖体系中壳聚糖的准确定量还不受脱乙酰度的影响，具有普遍适用性。

1.4 红外光谱法

红外光谱法实质上是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法，在壳聚糖的定量分析上应用较少，但适合于对壳聚糖复合物或衍生物的功能性基团的鉴别。壳聚糖的红外光谱集中在中红外区段，用其定量的重点在于某个基团的特征峰与壳聚糖浓度的变化存在线性关系。Tang[33]利用吡喃环上的次甲基的吸收峰(1 389和2 865 cm-1)面积比作为定量参照，建立了傅立叶变换红外光谱(FTIR)分析方法，可应用于药物中的壳聚糖的含量，但线性较差。

2 电化学分析法

电化学分析法具有装置简单，响应快、成本低、线性范围宽等特点，较早应用于壳聚糖的定量分析。由于壳聚糖没有电化学活性，需要与电化学探针如染料[34]、指示剂[35]等发生氧化还原反应。国内最早使用的方法为零电流电位滴定法，而近年来主要采用的是极谱法和伏安法。谭学才等[36]利用茜素红S作为电化学探针，伏安法测定，发现在低浓度和高浓度壳聚糖中峰电流分别有线性增敏和减敏效应。研究表明，由于壳聚糖的等电点是6.3，在pH为4.5的溶液中，壳聚糖分子有大量的氨基质子化带正电荷，壳聚糖与茜素红S之间通过静电作用和氢键作用结合，峰电流升高；而随着壳聚糖浓度继续增加，壳聚糖的双螺旋结构趋势增加，分子间氢键形成，使得茜素红分子镶嵌到双螺旋结构的内部或被包裹在壳聚糖聚集体中，导致峰电流降低。Lu等[37]突破性发现壳聚糖的降解产物中的碳氧基团本身具有明显的电活性，可在水银电极下发生氧化还原反应，峰电流位于-0.62 V和-0.54 V，线性范围宽，但灵敏度较低。该方法无需使用其他电活性物质，可以直接对壳聚糖进行定量。但电化学方法灵敏度较低，方法稳定性不佳，因而近年来，较少电化学法测定壳聚糖的报道。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱法具有专属性较强、准确性好、灵敏度高、检出限低等优点，其突出优势在于可以排除壳聚糖分子量和脱乙酰度差异带来的干扰。目前，利用高效液相色谱法对壳聚糖定量分析主要分为2种，一种是直接对壳聚糖进行检测，另一种是将壳聚糖水解为氨基葡萄糖(见图2)，再通过测定氨基葡萄糖间接定量。

图2 氨基葡萄糖结构

Figure 2 Structure of glucosamine

由于壳聚糖本身是一种大分子，弱紫外吸收且不具有荧光，对其直接测定，早年有采用氨基相柱分离，示差折光检测器检测[38]，虽然避免了氨基葡萄糖需要柱前衍生化等繁琐的步骤，但是设备要求较高，不利于推广使用。

国内外较多研究定位于将壳聚糖水解后，对水解产物氨基葡萄糖进行检测。氨基葡萄糖本身的极性较强，若利用常规的反相色谱法直接测定，保留时间短，不能达到较好的分离效果，因而通常需要先进行衍生化反应，得到衍生化产物极性降低，且带有发色基团或荧光基团，再上机检测。普遍采用反相柱为碳十八柱，紫外检测器或荧光检测器检测，常用的衍生化试剂主要有9-芴甲氧羰酰氯[39-41]、异硫氰酸苯酯[42]、邻苯二甲醛[43]。近年来，还有液质联用的报道，吴治将[44]用高效液相色谱法串联质谱法测定保健品中的甲壳素，先将样品经盐酸水解，再进行萃取，洗脱等前处理，以碳十八色谱柱和乙腈-0.1%甲酸水流动相体系进行梯度洗脱，采用电喷雾负离子多反应监测模式测定，方法灵敏度高，选择性好。最新研究表明，氨基葡萄糖也可用正相色谱直接检测，Pesek等[45]利用正相液相色谱法分别测定了从虾壳分离出来的氨基葡萄糖和氨基葡萄糖胶囊中的氨基葡萄糖和软骨素。实验对分离出来的氨基葡萄糖进行固相萃取，可以避免基体效应的影响，再采用二氧化硅氢化物填充的DH柱对氨基葡萄糖进行分离，梯度程序洗脱，质谱检测器检测其含量。构建的方法免去了衍生化的繁杂步骤，避免了多重反应带来的实验误差。

对于间接法测定壳聚糖，壳聚糖水解的过程是其定量分析的关键，如何提高水解产率，降低实验成本，一直是研究者关注的重点。壳聚糖的降解方法很多[46]，常用的方法是酸水解，较其他方法水解更彻底。研究成果表明，用单一盐酸(6 mol/L)水解，水解时间越长，水解温度越高，水解产率也越高，且密封条件下水解，可有效防止碳链被氧化。但是当温度超过110 ℃,氨基葡萄糖碳链会发生断裂，碳化较为严重，故温度不宜超过110 ℃。Li等[40]在试验中改良了酸水解的方法，在110 ℃下使用HCl-H3PO4(4.5∶1.5,摩尔比)对壳聚糖水解24 h，结果表明该方法的回收率明显比单一HCl水解的回收率高，结果满意。

但是，高效液相色谱法必须经过长时间的水解过程，水解产率不稳定，且需要柱前衍生化，操作较为繁琐，设备要求较高，实验条件的探讨较为复杂，成本较高。再者，该法仍存在壳聚糖水解产率不高和敞开式水解变性的问题，壳聚糖含量的计算方法能否与光谱学方法取得一致的问题上还需要进一步深入研究和验证。

4 其他方法

Beaudoin等[47]将壳聚糖进行酸水解，然后对水解后的氨基葡萄糖用高效毛细管电泳法和激光诱导荧光检测器进行测定，操作较为复杂，受水解条件影响较大。Nitschke等[48]用多碘化合物与食用蘑菇中甲壳素或壳聚糖反应生成不溶性多糖复合物，用凝胶成像系统测定该复合物的光密度，从而得出甲壳素或壳聚糖的含量，线性关系良好，检测范围0.5～5 mg/mL，但只适合用于蘑菇细胞提取物的壳聚糖的测定，应用范围窄。

5 小结及展望

随着食品安全意识与食品质量标准的提高，壳聚糖质量标准的控制尤为重要。光谱法具有操作简便，成本低、灵敏度较高等优点，受到了研究者的广泛关注，相对而言，分光光度法和荧光淬灭法的研究报道较多，但灵敏度均不如共振瑞利散射法，且易受共存物质的干扰，选择性较差。目前，使用共振瑞利散射法对壳聚糖的研究报道较少，将是今后研究发展的一大热点。而红外光谱法特殊作用在于对分子结构和官能团的鉴别，较适合于壳聚糖类衍生物特征组分的分析。电化学方法操作简单、线性范围宽，但其灵敏度和稳定性均不够理想。高效液相色谱法通常建立在壳聚糖的水解及衍生化的基础上，专属性好、灵敏度高且选择性好，壳聚糖水解和氨基葡萄糖的柱前衍生化是2个关键步骤，壳聚糖水解不完全将影响测定结果的准确性。

再者，壳聚糖是一种天然高分子化合物，分子量和脱乙酰度是其两大物理特性，在利用静电结合作为定量基础的情况下，仅有脱去乙酰基的氨基能与阴离子的分子结合，部分乙酰氨基并不能与阴离子分子结合。当实际样品中壳聚糖分子量及脱乙酰度与标准品的分子量及脱乙酰度存在较大差异时，检测结果可能存在一定的系统误差。因此，定量分析方法的建立，必须考虑壳聚糖分子量和脱乙酰度的影响。目前的电化学法和光谱学检测方法普遍忽略了壳聚糖本身性质对其准确定量的影响。高效液相色谱法是在壳聚糖水解后对氨基葡萄糖进行定量分析，可以排除脱乙酰度和分子量对其准确定量的影响，在这方面具有明显优势，但是，如何使壳聚糖水解完全仍然是一大难题。

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(责任编辑：王昌栋)

Progress on the quantitative analysis of chitosan

MA Caijuan,ZHANG Weiai,SU Zhengquan,BAI Yan

(SchoolofPublicHealth,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510310,China)

Chitosan is currently the unique cationic alkaline polysaccharide in nature,with the function of reducing weight,strengthening immunity and so on,which has attracted much attention in the field of medicine and functional foods. Thus,the quality control of chitosan products becomes an important topic. This paper reviews the main technology on quantitative analysis of chitosan,including spectrophotometry,electrochemistry and high performance liquid chromatography (HPLC),etc. In order to provide a new way of thinking for the quantitative analysis of the chitosan in various samples,the development of the determination of chitosan is prospected.

chitosan; quantitative analysis; spectrophotometry; electrochemistry; high performance liquid chromatography

2016-09-05

国家自然科学基金项目(81173107)

马彩娟(1991—)，2014级硕士研究生，主要从事环境与职业卫生监测，Emali:mcjane2013@163.com；通信作者：白研(1970—)，教授，主要从事卫生检验与药物分析研究，Email:angell_bai@163.com。

时间：2016-11-25 14:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161125.1435.003.html

R284.1;O65

A

1006-8783(2016)06-0805-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016090503