新生大鼠NEC致肠管时序性病理变化

周永翠， 王广欢

(1.汕头大学医学院第一附属医院，广东汕头 515041； 2.汕头大学医学院第二附属医院)



新生大鼠NEC致肠管时序性病理变化

周永翠1， 王广欢2

(1.汕头大学医学院第一附属医院，广东汕头 515041； 2.汕头大学医学院第二附属医院)

目的：探讨坏死性小肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)肠管的病理变化以及凋亡因子Bax、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCAN)、血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)表达与时间的关系。方法：140只新生SD大鼠随机分为NEC组和对照组。NEC组给予缺氧冷刺激加人工喂养。于建模后第1-7 d，每组每天处死10只，取结肠、回肠末段行病理学检查。并根据组织学诊断标准分为0-4分,评分>2为NEC。检测回肠、结肠中PCNA、Bax、PAF的表达。结果：第1 d，肠管受损最严重，第3 d、第5 d损伤依次降低，第7 d器官的炎性改变基本吸收。Bax在肠管凋亡最重，有时间差异。PCNA在肠管增殖先弱后强。PAF在肠中增高。结论：NEC后会引起肠原发性损伤，且呈现不同的凋亡、增殖和炎性因子的变化，且损伤修复程度和时间各有不同，总体在建模后第4 d肠管修复起主导作用。

坏死性小肠结肠炎；血小板活化因子；增殖细胞核抗原

新生儿坏死性小肠结肠炎是新生儿阶段一种严重威胁患儿生命的胃肠道急症，是新生儿中最常见、最具破坏性的疾病之一[1]。有关坏死性小肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)发病机理和特异性治疗措施的研究己成为儿科学的重要课题。目前NEC的建模方法繁多，尚无统一标准，本实验在以往NEC模型建立基础上，力求选择一种较理想科学的建模方法，为能更好的了解NEC的病因及发病机制，制定更有效的治疗方法，提供模型基础。

目前，对于NEC的研究多集中在病因和发病机制上，以及对于受伤肠管单个时刻的保护和预防方面，而对于NEC发生后肠管的时序性病理和功能变化，缺乏一个系统的研究和认识。本文通过建立NEC动物实验模型，研究NEC后新生大鼠的回肠、结肠病变过程，并检测上述各器官中凋亡因子Bax、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCAN)、血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)的表达，以期从炎症损伤、凋亡、增殖3方面动态了解NEC发生后肠管的病变过程，了解NEC后机体病理进展以及转归的变化规律特点。

1 材料与方法

1.1NEC模型建立与分组 140只新生SD大鼠随机分为NEC组和对照组，各70只。新生大鼠NEC模型的建立参照文献[2]，采用鼠代乳品人工喂养及缺氧冷刺激(100 %氮气缺氧90 s、4 ℃冷剌激l0 min，2次/d，连续3 d)的方法建立新生大鼠NEC模型。

1.2材料 分别于建模后第1-7 d，每组每天颈椎脱臼法处死10只，以止血钳、手术剪刀剖腹，打开腹腔分离胃肠道，观察并记录肠管颜色，有无出血，回肠膨胀、坏死及穿孔情况，并用数码相机拍摄照片(MVC-FD91，Sony)，各组大鼠均留取回盲部结肠、回肠标本用于形态学观察。

1.3病理切片制作及HE染色 生理盐水冲洗后立即固定于10 %福尔马林中48 h，石蜡包埋，常规制备4～6 μm组织切片并进行HE染色。判定标准：HE染色后在光镜下观察肠组织形态改变，根据肠组织固有层分离，中性粒细胞浸润，绒毛脱落，坏死，血管扩张，间质水肿，分为4级。每例新生鼠回盲部肠组织标本观察3个视野，取其平均值，评分标准参照Nadler EP报道的标准[3]。组织学评分≥2分确定为NEC。

1.4免疫组化学染色 检测建模后1-7 d正常组和NEC组回肠和结肠中Bax、PCNA和PAF的表达。结果判定：光学显微镜下观察着色反应，结果以细胞核或细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性结果。应用Image-proplus 5.1图像分析软件进行分析。

1.5统计学分析 采用SPSS 16.0统计学软件分析数据，单因素方差分析(One-way ANONA)，组间比较用LSD检验，方差不齐采用Dunnet’T3检验，计量资料用(均数±标准差)表示，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1NEC致结肠、回肠损伤的病理改变 NEC组建模后第1 d见肠绒毛脱落、坏死致结构消失，黏膜下及肌层水肿，肠壁淤血、出血、坏死伴大量炎细胞浸润，以中性粒细胞为主，组织学评分多为3分和4分，至建模后第3～5 d时组织学评分多为2分，至建模后第7 d组织学评分多<1分。

2.2Bax在结肠、回肠中的表达 Bax在肠绒毛上皮细胞表达。Bax在NEC组肠管中表达强于对照组。随后逐渐下降，至第7 d时表达水平最低。定量分析结果，在NEC组的回肠和结肠中，Bax表达高于对照组，见图1。

2.3PCNA在结肠、回肠中的表达 PCNA表达在肠上皮细胞核中，PCNA在NEC组中建模后第1 d肠较正常降低。随后逐渐增强至建模后第4、5 d。定量分析，在NEC组的肠管中PCNA表达低于正常对照组，见图2。

2.4PAF在结肠、回肠中的表达 PAF表达部位同Bax，PAF在NEC组第1 d肠较正常对照组增多，随后逐渐增高至第4 d时开始下降，第7 d时接近正常水平。定量分析结果，在NEC组，肠管中PAF表达高于正常对照组，见图3。

3 讨论

3.1NEC模型建立及评价 近年来NEC的研究成为热点，动物模型是研究其病因、机制及有效防治的基础。国内外关于NEC的建模方法很多，每种建模方法都有很多不同。大量研究证实，NEC发病是多因素的，于是近年来研究人员开始尝试采用多因素联合建立NEC动物模型[4]。

本研究表明，应用新生SD大鼠进行缺氧、冷刺激及人工喂养操作能造成明显病理改变的NEC模型，符合NEC的诊断标准，且与人类新生儿NEC病理变化及临床表现一致，显示该 NEC动物模型的方法成功，且具有科学性和合理性。

3.2NEC模型中肠时序性病理损伤以及凋亡、增殖和炎性因子变化及意义 NEC后肠管的损伤和炎性反应以及损伤后修复等的病理变化均伴随了细胞增殖、凋亡和炎性因子的改变。

虽然末期NEC组织病理学表现为典型肠组织广泛坏死，但在疾病初期，凋亡可能是NEC肠上皮细胞死亡的主要方式[5]。目前，炎性反应相关的多脏器功能失常综合征的凋亡相关基因中Bax研究较多。表明NEC后各器官均引起细胞凋亡的增加，特别是受损最重的肠管，自身反应不同，出现下降的到稳定的时间的先后。

PCNA被广泛应用于研究细胞增殖动力学。本研究表明，NEC时肠上皮细胞增殖减少，肠道损伤后修复功能降低。在小肠缺血再灌注损伤时，PCNA的表达变化与肠道上皮细胞增殖分化相一致，可能与损伤后的肠黏膜自身修复相关[6]。另外，本研究表明在建模后第4 d后肠管的损伤才处于正性修复阶段。

近年来，研究证实PAF在NEC的炎症连锁反应中发挥关键作用。结果表明，NEC后包括肠道损伤后，由致炎物质进一步激活，在上皮、腺体和炎细胞合成大量的PAF，形成恶性循环，故NEC后肠中 PAF表达较正常增高[7]。另外，不同器官中回肠PAFR基因转录不同，以回肠最高。提示PAF在不同的部位其合成的组织和细胞也不全相同，其具体机理有待进一步的研究。

总之，NEC后会引起肠原发性损伤，且呈现不同的凋亡、增殖和炎性因子的变化，且损伤修复程度和时间各有不同，总体在建模后第4 d器官修复起主导作用。

[1] 曾振华.新生儿坏死性小肠结肠炎研究现状及发展趋势探究[J].中外医学研究,2014,12(27):152-153.

[2] 刘斌,阎静江,李晓霞.新生鼠坏死性小肠结肠炎动物模型建立方法改进[J].中国现代医生 2015,53(35):22-25.

[3] Nadler EP,Upperman JS,Ford HR.Controversies in the management of necrotizing enterocolitis.[J].Surgical Infections,2001,2(2):119-120.

[4] 郑晓辉,周伟.坏死性小肠结肠炎动物模型简介及评价[J].中国新生儿科杂志,2010,25(2):116-118.

[5] 刘健,陈競芳,卓玲,等.肠细胞凋亡在新生鼠坏死性小肠结肠炎肠损伤中动态变化[J].中国新生儿科杂志,2008,23(6):349-352.

[6] 王运星,吴承堂,殷刚,等.小肠缺血再灌注损伤时肠道上皮细胞PCNA的表达[J].中国普通外科杂志,2009,18(4):409-411.

[7] 陈霞,吴有良,陈晓熹.烟酰胺对大鼠坏死性小肠结肠炎模型的保护作用[J].中国新生儿科杂志,2015,30(4):294-297.

Sequential pathological changes of intestine tubes induced by NEC in neonatal rats

ZHOU Yongcui1,WANG Guanghuan2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouMedicalCollege515041,China;2.TheSecondAffiliatedHospitalofShantouMedicalCollege)

Objective:To explore the pathological changes of intestine tubes induced by necrotizing enterocolitis (NEC) and the relationship between expression and time of the apoptosis factor Bax, proliferating cell nuclear antigen(PCAN) and platelet-activating factor (RAF). Methods:140 neonatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into Group NEC and the contrast group. NEC models were established by artificial feeding, hypoxia and cold stimulation. 10 rats were killed in each group from the 1st day to the 7th day after modeling and the terminal ileum, colon were selected for pathological examination. The scores ranged from 0 to 4 based on the histological diagnostic criterion. The score >2 indicated NEC. The expression levels of Bax, PCNA and PAF in the ileum and the colon were determined. Results:The damage to the bowel was the most serious on the first day. On the third day, the score of intestine injury in rats was significantly lower than that on the first day. On the fifth day, the organ damage was significantly reduced compared to that on the third day. Inflammatory changes of the organs were almost absorbed on the 7th day. There was difference in terms of the time of apoptosis factor Bax, which was damaged the most seriously in intestine tubes. In the intestine, the proliferation was from weak to strong ; the expression of PAF was increased. Conclusions:NEC can lead to different degrees of primary injury of intestines, apoptosis, proliferation, and the degree and time of injury and repair are different. In general, instestinal repair plays a leading role on the 4th day after modeling.

Necrotizing enterocolitis; Platelet activating factor; Proliferating cell nuclear antigen

王广欢

2016-06-15)