山羊乳饼中乳酸菌的多样性研究

王昱敬，杨海秀，刘雪英，郭洁，黄艾祥

（云南农业大学a.食品科学技术学院；b.龙润普洱茶学院，昆明650201）

山羊乳饼中乳酸菌的多样性研究

王昱敬a，杨海秀a，刘雪英a，郭洁b，黄艾祥a

（云南农业大学a.食品科学技术学院；b.龙润普洱茶学院，昆明650201）

云南省西北部的剑川县传统上有加工羊乳饼的历史，其产品工艺独特，选用的凝乳剂为发酵酸乳清和贯筋藤浸泡液，乳饼中的乳酸菌资源值得探索。对采自剑川县3个镇的12份羊乳饼样品采用传统培养方法结合16S rRNA基因序列进行鉴定，并绘制乳酸菌系统发育树，探索进化途径和亲缘关系。乳饼中乳酸菌活菌数均大于6.0×107g-1，共鉴定42株乳酸菌，分为6个属，12个种和2个亚种，其中34株杆菌分离株归属2个不同属中的8个种，8株球菌分离株归属4个不同属中的6个种，Lactobacillus plantarum和Lactobacillus fermentum是优势菌株，分别占总分离株的30.95%和21.43%。研究结果有利于乳酸菌资源开发利用。

乳饼；乳酸菌；分离鉴定；16S rRNA基因

0 引言

羊乳饼以鲜羊奶为原料，加热至80℃左右，添加凝乳剂（发酵酸乳清和贯筋藤浸泡液），凝乳、排除酸水、压制成型，其质地柔软、营养丰富[1]。

乳酸菌具有调节人体肠道内菌群平衡、抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压和免疫调节[2-5]等益生功能，因此在传统发酵乳制品中筛选优良益生特性的乳酸菌已成为研究的热点。刘文俊等[6]对云南省大理州20份乳扇样品的乳酸菌多样性进行研究，共鉴定出85株乳杆菌和9株球菌；杨希良等[7]对云南撒尼地区乳饼及酸乳清中乳酸菌的鉴定及其生物多样性研究，共鉴定出73株乳酸菌，其中Lactobacillus plantarum和Weissellaconfuse为优势乳酸菌，分别占总分离菌株的19.18%和15.07%。本文拟采用凝乳剂为发酵酸乳清加贯筋藤浸泡液加工工艺的羊乳饼，进行乳酸菌的探索研究。

1 实验

1.1材料和仪器

1.1.1 材料

样品：云南省剑川县3个镇的12份羊奶乳饼，采集信息如表1所示。

1.2.1 主要培养基及试剂

培养基：MRS营养肉汤，M17营养肉汤。

试 剂：革兰氏试剂盒，质量分数为3%过氧化氢溶液，丙三醇，DNA抽提试剂盒，PCR扩增引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

超净工作台（SW-CJ-1FD），澳柯玛超低温冰箱（DW-86L390），电热恒温水浴锅（XM7D-4000），立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-70A），高速离心机（HC-2062），数显电热培养箱（HPX-9272ME），漩涡振荡器（QL-861），光学显微镜（BH200）。

表1 剑川地区羊乳饼种类来源

1.4方法

1.4.1 菌落计数

菌落总数的测定、乳酸菌总数的测定、按照《食品微生物学检验乳酸菌检验》中GB/T 4789.2-2010、GB/T 4789.35-2010执行。

1.4.2 样品的分离、纯化与初步鉴定

采用倾注法，将已灭菌的0.9%生理盐水配制一系列的样品梯度稀释液，取10-7，10-8，10-9三个稀释度。根据菌落形态特征，划线分离纯化2～3次后，挑取单菌落于MRS培养液中培养24 h。经革兰氏染色后镜检，同时进行过氧化氢酶实验和菌种培养液pH值测定，确定纯种、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株置于-80℃超低温冰箱中保藏[8-15]。

4.构建完善的金融衍生品市场准入制度。我国金融衍生产品市场发展还不成熟，因此实行审批以控制市场风险，这是十分必要的。但是，为了顺应世界金融发展趋势，提高中国金融衍生品市场的分量，必须要在审慎监管的理念下，完善目前仍有空白、漏洞的市场准入程序，减少因为制度漏洞这样的低级错误带来的风险。另一方面，要适当精简衍生品上市的申请环节，提高审批效率，给予交易所一定的发展空间，促进本国金融市场的创新［7］191。例如美国已经建立对某些现金结算的期货和期权合同审批的快捷通道，申请要求在受理后10天就可以得到批复，同时考虑允许交易所在未经批准的情况下上市新合约。

1.4.3 乳酸菌16S rRNA序列鉴定

乳酸菌DNA提取釆用生工生物DNA提取试剂盒，用PCR扩增乳酸菌DNA的16S rRNA基因目的的片段，25 uL的反应体系，通用引物27F（5’-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’），染色体DNA为模板进行聚合酶链式反应扩增。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸2 min；30次循环；72℃末端延伸10min[16]。PCR产物送到上海生工生物技术有限公司进行双向测序，每株菌获得两条16S rRNA基因的序列，运用DNAStar 6.1软件包中的SeqMan软件拼接，获得约1500 bp的有效序列[17-18]。登陆网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/进行序列比对，结合形态学特征和理化特性确定与比对的目的基因序列同源性最高的已知分类的菌种。

1.4.4 系统发育树的构建

从GenBank数据库中下载与所测菌株相对应的16S rRNA基因序列，利用ClustalX 2.0.12进行多重比对，得到同源性相似百分比。再采用MEGA 4.0软件构建系统发育树，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析，并进行1000次重复的Boot-straps统计学检验[19]。

2 结果与分析

2.1乳饼的乳酸菌

测定结果如表2所示。

表2 乳酸菌菌落计数结果

由表2可以看出，在12份羊乳饼样品中，有3份乳酸菌落总数在（6.0～9.3）×107g-1之间，有7份乳酸菌落总数在（2.1～9.8）×108g-1之间，有2份乳酸菌落总数为（2.0～8.0）×109g-1之间。这表明剑川羊乳饼中的乳酸菌资源较为丰富,有利于进一步的分离鉴定。

2.2分离菌株的理化特性

分离菌株的理化特性如表3所示。由表3可以看出，42株分离株的培养液pH值最小低至4.10，除了一株为4.79外，其余菌株均在4.75以下；全部分离株的菌体革兰染色均呈阳性；过氧化氢酶实验仅有1株为阳性，其余均为阴性，由菌株形态学特征结合理化特性可鉴定出42株疑似乳酸菌菌株。

2.3系统发育树的构建与分析

选取部分代表性的菌株用Mega 4.0构建系统发育树（如图1所示）。

图1 系统发育树

由图1可以看出，菌株DNR2-1和DNR5-1与标准菌株Lactobacillus plantarum NRRL B-14768的亲缘关系最近，且同源性达到99%以上，故被鉴定为L.plan⁃tarum。菌株DNR3-2和DNR3-6分别与标准菌株weissella confusa JCM 1093和标准菌株Lactococcus Lactis NCDO 604T的系统位置最接近，且同源性达到99%以上，故被鉴定为weissella confusa和 L.Lactis。菌株DNR3-5与标准菌株Leuconostoc Luctis ATCC 19256聚为一类，且同源性达到100%，故被鉴定为L.Luctis。菌株DNR5-4和JHR1-3分别与标准菌株Lactobacil⁃lus reuteri JCM 1112，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgari⁃cus ATCC 11842的距离最近，且同源性达到100%，故被鉴定为L.reuteri和L.delbrueckii subsp.Bulgaricus。

表3 分离菌株的理化特性

2.4分离菌株种属

结合菌株系统发育树和测定序列比对情况，对42株分离株进行属种鉴定，结果如表4所示。

表4 羊乳饼样品中42株分离株的属种鉴定结果

由表4可以看出，分离自剑川县12份样品中的42株乳酸菌鉴定为6个属（Lactobacillus，Weissella，Lacto⁃coccus，Enterococcus，Leuconostoc和Streptococcus）中的12个种，包括4株Weissella confusa，1株Weissella cibaria，1株Leuconostoc Lactis，1株Lactococcus lactis，9株Lactobacllus fer⁃mentum，13株Lactobacillus plantarum，1株Lactobacillus para⁃casei，1株Streptococcus equinus，3株Streptococcus macedonicus，3株Lactobacillus casei，1株Enterococcus faecium，1株Lacto⁃bacillus reuteri，Lactobacillus plantarum和Lactobacllus fermen⁃tum，2个亚种（2株Lactobacillus delbrueckii subsp和 1株Streptococcus gallolyticus）。其中乳杆菌分离率高于乳球菌，这可能是由于羊乳饼样品在制作过程中有加热、蛋白质变性的工艺，对乳球菌的生长存活不利，使得羊乳饼中的乳杆酸菌数量较多。

2009年，张宜凤等[20]从大理州洱源、邓川等地区采集的乳扇、乳饼、奶疙瘩及酸浆样品中分离获得肠球菌、乳酸乳球菌及同型发酵乳酸杆菌为主要菌群。2010年，孙志宏等[21]从蒙古国戈壁阿拉泰、东戈壁等地区采集自然发酵牛乳样品20份，从中分离鉴定出74株乳酸菌，其中发酵乳杆菌(L.fermentum)和瑞士乳杆菌(L.helveticus)为该地区自然发酵牛乳的优势乳酸菌。2013年，陈芝兰等[22]研究了西藏不同地区传统发酵乳中乳酸菌的多样性，发现了明串珠菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属及乳球菌属，其中乳杆菌属的数量最大，干酪乳杆菌为主要优势菌群。对我国传统发酵乳制品中分离出的乳酸菌进行研究，发现乳酸菌因环境和制作工艺不同，其种类和数量等存在较大差异。

3 结论

云南省剑川县传统羊乳饼中蕴含着丰富多样的乳酸菌资源，是我国乳酸菌研究和资源开发的一个天然宝库。乳酸菌菌落计数结果均在6.0×107g-1之上，表明剑川羊乳饼中的乳酸菌资源较为丰富；12份羊乳饼采用16S rRNA基因序列分析技术和传统理化特性研究相结合共鉴定出42株乳酸菌，分为6个属，12个种和2个亚种，其中Lactobacillus plantarum和Lactobacllus fermentum是剑川羊奶乳饼样品中的优势菌株，剑川地区的乳酸菌种类与其他地区相比较具有明显的差异性，这可能与当地山羊乳饼的制作工艺、气候环境和地理位置等因素有关。本研究为认识云南剑川地区的乳酸菌属种提供一定的理论依据，为今后研究和开发利用乳酸菌资源提供参考。

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Diversity of Lactic Acid Bacteria in goat dairy cake

WANG Yu-jinga,YANG Hai-xiua,LIU Xue-yinga,GUO Jieb,HUANG Ai-xianga
(Yunnan Agricultural Universitya.College of Food Science and Technology；b.College of Pu-erh tea,Kunming 650201,China)

Jianchuan,Yunnan has a long history of making a unique type of goats'milk cake.The milk coagulant used in the dairy cakes are of the soak solution of fermented acid whey and Dregea sinensis Hemsl.var.corrugate,whose lactic acid bacteria are of great value to explore. For 12 shares of goat dairy cakes from three towns in Jianchuan County had identified by adopting traditional culture methods of coupled with 16S rRNA gene sequence,and phylogeny trees of lactic acid bacteria are drawn out to explore their evolutionary pathways and genetic relationships.The LAB counts in cheeses were greater than 6.0×107g-1.42 strains of lactic acid bacteria are identified in the experiment,con⁃sisting of 6 genus,12 species and 2 sub-species,among which 34 strains of bacillus isolates affiliate to 8 species of 2 genus,and 8 strains of coc⁃cus isolates belong to 6 species of 4 genus,Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum are dominant strains,accounting for 30.95%and 21.43%of the total isolates,respectively.The results of the study is beneficial to resources development and utilization of LAB.

dairy cake;Lactic acid bacteria;Isolation and identification;16S rRNA gene

TS252.56

A

1001-2230（2016）09-0020-04

2016-03-28

云南省现代奶牛产业技术体系项目（2015KJTX008）；云岭产业技术领军人才项目（云发改人事（2014）1782号）。

王昱敬（1991-），男，硕士研究生，研究方向为食品资源与乳品科学。

黄艾祥