乳源性小肽DELQ的抗衰老功效研究

沈鹏，程志才，陈静，李婉如，占东升，张少辉，3

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司，浙江温州325800；3.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海200240）

乳源性小肽DELQ的抗衰老功效研究

沈鹏1，程志才1，陈静1，李婉如1，占东升2，张少辉1，3

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司，浙江温州325800；3.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海200240）

在体外研究结果表明，乳源性小肽DELQ具有良好的生物活性基础上，采用秀丽线虫为实验模型，研究DELQ的抗衰老功效。首先以生殖能力为指标，在线虫培养基中添加不同浓度的DELQ，选出最佳作用浓度；同时设立对照组和实验组，评价DELQ对线虫寿命以及生殖能力的影响。然后采用热应激和氧化应激实验，探讨DELQ的抗衰老机理。结果表明：400 mg/L的DELQ为最佳作用质量浓度；DELQ在一定质量浓度下能延缓线虫衰老，显著增加SOD质量浓度；提升线虫生殖能力；耐热力增加不明显；但能显著提高线虫的抗氧化力，MDA及ROS值均下降，SOD明显增高。因此，乳源性小肽DELQ能通过清除自由基，提升机体抗氧化力来延缓线虫衰老，故推测DELQ具有一定的抗衰老功效。

乳源性小肽；最佳作用浓度；抗衰老；秀丽线虫

0 引言

乳源性小肽来源于天然发酵乳制品，是一种安全的食物成分。同时，又因其可能具有多种生物活性，如抗衰老、抗氧化以及免疫调节等功能，具有很好的应用前景，正在成为热门的研究课题[1-2]。目前，已有大量活性肽被发现，如抗氧化肽、免疫调节肽等[3-5]。在本课题研究前期阶段，卢珊珊等[6]经过长期研究，发现来自瑞士乳杆菌发酵乳中的生物活性肽Asp-Glu-Leu-Gln（DELQ）具有较好的清除自由基及体外抗氧化活力，并和浓度呈正相关性。

根据导致衰老的自由基理论[7]，在正常生物体内代谢产生的超氧阴离子自由基（O2-）是引起衰老以及与衰老相关疾病的主要原因之一。金赢凯等[8]发现乳源性小肽LPLP具有改善动物的抗氧化功能，并能够减轻小鼠因衰老而产生的炎症。

本文以秀丽线虫作为动物模型，从多个指标出发研究了DELQ抗衰老功效及其发挥抗衰老作用机理。

1 实验

1.1材料与设备

实验动物：秀丽线虫（Caenorhabditis elegans），大肠菌株E.coli OP50。

实验试剂：胰蛋白胨、琼脂粉、酵母粉、质量分数30%过氧化氢溶液；5-氟脲嘧啶、胆固醇；活性氧（ROS）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒；DELQ，纯度＞95%。

实验设备：THZ-32型台式恒温振荡器，酶标仪，GL-22M高速冷冻离心机，JY92-ⅡD超声波细胞粉碎机，HWS26电热恒温水浴锅，TDL-40B离心机。

1.2方法

1.2.1 大肠杆菌培养与涂布

取大肠杆菌菌种于LB平板划线，挑取单菌落于10 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min，振荡培养24 h，至OD600=0.4用于接种NGM平板喂养线虫。取100 μL菌液涂于60 mm NGM平板，注意菌液边缘应距离平板边缘0.5 cm左右。已涂布的NGM平板在室温（21～25℃）过夜后即可使用。

1.2.2 线虫培养

参照S.Brenner[9]所用方法进行线虫培养。本实验中所用的线虫均为雌雄同体，在标准培养条件（温度20℃，湿度40%～60%）下培养生长。

1.2.3 线虫的同期化与保存

（1）准备孕虫生长板（即板中80%以上虫子处于生殖期）2-3板，取5 mL M9缓冲液冲洗2次，将缓冲液吸入15 mL离心管中，1 000 g（3 min）离心，弃去上清。加入5 mL新配同期化漂白液，室温下剧烈振荡2.5 min，以将成虫虫体腐蚀。离心，弃去上清。保证总处理时间不能超过5 min，防止损伤虫卵。再加入M9缓冲液将沉淀重悬，混匀后离心，弃去上清，重复此过程3次。

（2）培养3～5板线虫，确保平板中60%以上的线虫进入休眠期，用M9缓冲液冲洗完全后放入30%甘油，于-80℃保存，一个月后取出同批冻存中的1～2个样本复苏，以检验复苏成功率。

1.2.4 肽质量浓度-效果检测实验

结合文献以及预实验结果将DELQ质量浓度定为100，200，300，400，500 mg/L。实验分组：0 mg/L（空白组），100，200，300，400和500 mg/L 6组；进行生殖实验以选出DELQ作用的最佳剂量。

1.2.5 生殖实验

本研究以秀丽线虫作为动物模型，参照J.Gruber等[10]的方法，挑取同期化处理后的L4期线虫到相应质量浓度的NGM板中。每个浓度至少8条线虫，每个NGM板转入一条，记为0天，以后每天移至新板中直至线虫生殖基本不再产卵，在其进入产卵期之前对线虫总产卵数进行计数。

1.2.6 寿命实验

实验分组：对照组和DELQ组。参照B.Lakowski等[11]的方法，选取L4期线虫若干条，同期化处理后，分别置于相应NGM板中；每组线虫数量不少于60条，此时记为0 d，每天将它们转移到新板中，到生殖后期不再转移。每天记录线虫死亡及剔除出实验的条数。其中寿命实验每个NGM板中含有质量浓度为12.5 mg/L 5-氟脲嘧啶以抑制线虫生殖。

线虫死亡判断标准：无移动及吞咽动作，轻触后仍无任何反应。剔除标准：①逃离至平板壁或盖上而干死；②虫卵在体内孵化而成袋样虫：③钻入琼脂中。

1.2.7 压力应激实验

1.2.7.1 急性热应激实验

实验分组：对照组和DELQ组。参照Mark等[12]的方法，将同期化处理后的L4期线虫置于相应NGM板中，每板不少于40条，实验置于35℃进行，每隔1 h计数线虫死亡、存活数目，线虫死亡标准同寿命实验。

1.2.7.2 急性氧化应激实验

实验分组：正常组和DELQ组。参照A.Duhon等[13]的方法，将同期化处理后的L4期线虫置于相应NGM板中，实验在浓度为20 mmol/L的H2O2的NGM平板中进行，每板数量不少于10条，每半小时计数线虫死亡、存活数目。线虫死亡标准同寿命实验。

1.2.8 超氧化物歧化酶、丙二醛及活性氧测定

实验分为无处理实验组、加热处理实验组及氧化处理实验组。其中，无处理实验组又分为空白无处理组和DELQ无处理组，培养方法同寿命实验，待线虫长至L4期，用M9缓冲液将其冲洗并离心，去除上清液，加入PBS缓冲液，超声破碎2 min，离心得到其组织匀浆上清液，并立即进行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及活性氧（ROS）指标测定。加热处理实验组又分为空白热处理组和DELQ热处理组，培养方法同急性热应激实验，培养2 h后，测定其各项指标，检测方法与无处理实验组相同。氧化处理实验组又分为空白氧化处理组和DELQ氧化处理组，培养方法同急性氧化应激实验，培养1 h后，测定其各项指标，测定方法与无处理实验组相同。

1.2.9 统计学分析

实验结果所有数据均用SPSS软件进行处理，成对数据t检验进行显著性分析，当P<0.05时认为具有显著性差异，P<0.01时认为具有极显著差异。当P>0.05虽然认为在统计学上不具有显著性差异，但不排除生理学上有显著性差异的可能。

2 结果与分析

2.1生殖实验结果

实验结果如表1所示，与不喂食DELQ的空白组相比较，喂食不同质量浓度的实验组中，其平均产卵数均有不同程度的增加。但当喂食质量浓度为400 mg/L时，线虫平均产卵数与空白组相比具有显著差异（P＜0.05），其繁殖力得到明显提升。此实验结果表明，400 mg/L为最适质量浓度。但随着质量浓度的增加，线虫的生殖能力却不再出现明显提高。

类似现象在其他实验中也有发现，陆沛等[14]利用不同浓度梯度的白藜芦醇喂食线虫，发现并非喂食药物浓度越高效果越好。王艳菊等[15]用葡萄籽原花青素以100，200，300 g/mL质量浓度梯度喂养线虫时发现，当质量浓度为200 g/mL时，线虫平均寿命延长最为明显。因此，有可能是400 mg/L的DELQ质量浓度已达到其在线虫体内发挥作用的阈值，而随着浓度的增加，其作用效果不再明显提高。与此同时，热量限制学说[16]也逐渐被接受。通过限制食物的摄取可以延长线虫、果绳等的寿命，其机制可能与降低代谢率、减少氧化应激等的发生有关[17]。所以，猜测还有可能是DELQ达到一定质量浓度后，出于热量限制的因素，线虫不再摄食。

本研究以线虫生殖能力为指标，筛选得到DELQ最佳作用质量浓度为400 mg/L。以此作为寿命实验、急性应激实验的浓度。生殖能力实验可以用来评价药物在延寿作用的同时对生殖能力有无损害，是否为通过生殖与寿命之间的“利弊权衡”机制而起作用。而这种“利弊权衡”机制最为合理的解释就是“有限资源的矛盾需求”学说[18]。

表1 不同质量浓度DELQ对秀丽线虫生殖能力的影响

但随着研究的进一步深入，发现很多自然界中具有延长寿命功效的天然物并不均遵循此机制。本实验室高扬等[19]发现果蝇寿命的延长是QEPV直接作用的结果而非通过降低繁殖力实现的。同时，本研究预实验也发现DELQ延长线虫寿命的机制也并非通过抑制生殖实现。因此，采用线虫生殖能力为指标优化DELQ浓度是最为有效、快速的方式，得到的结果适合后续实验。

2.2寿命实验结果

由表2可以看出，当喂食质量浓度为400 mg/L时，实验组中线虫的平均寿命延长了约7.20%，同时，其半数死亡时间得到了显著性提高（P＜0.05），而最长寿命时间相比于空白组也延长3 d。图1中更是可以直观地看出，相同时间点，实验组中线虫存活率均明显高于空白组，线虫寿命得到延长。

这证明DELQ能够有效延缓线虫衰老，提高存活率，而同时也进一步证明DELQ延长寿命的作用并非通过抑制线虫繁殖力来实现，推测可能是因其具有良好的抗氧化功能和较强的清除自由基能力。

表2 DELQ对线虫寿命的影响

图1 DELQ对线虫寿命的影响

衰老是一个高等级、也是最基本生物体中普遍存在的生物学过程，主要表现在机体功能减退、环境适应能力及抵抗能力下降。根据导致衰老的自由基理论，生物体在新陈代谢过程中产生的超氧阴离子自由基（O2-）是引起机体衰老主要原因之一[20]。目前已有大量文献报道具有延缓衰老、减少机体发病的活性化合物，而小分子活性肽正是其中一种有效物质。Aru⁃mugam等[21]发现干酪乳杆菌代谢产物喂食线虫能够显著提高其存活率，推测可能是乳酸菌分解底物所产生的活性多肽发挥着作用。关树文等[22]利用单体亚血红素六肽（DhHP-6），发现其能有效提高秀丽线虫的平均寿命20%左右，延缓线虫衰老。这说明小分子多肽具有较强的抗氧化、清除自由基的功能，本实验的结果也证明了这一点。

2.3压力应激实验结果

2.3.1 热应激实验

由表3可以看出，在热应激条件下，实验组和空白组中半数死亡时间和平均寿命并无显著性差异，而实验组中最长寿命仅延长了1 d。由图2可以看出，线虫在0～10 d之内，空白组与实验组并无明显区别；在10 d之后，实验组存活率略高于空白组。

这说明在热应激条件下，饲喂DELQ对于延长线虫寿命的效果并不显著。

表3 DELQ对线虫在热应激下的影响

图2 DELQ对线虫在热应激下的影响

2.3.2 氧化应激实验结果

由表4可以看出，实验组线虫在氧化应激下平均寿命具有显著性提高（P＜0.05），其半数死亡时间也相应在一定程度上有所延长。如图3所示，在氧化应激条件下，实验组存活率均明显高于空白组存活率。

这说明在氧化应激条件下，线虫的存活率得到了显著提高，可能是由于其能有效帮助线虫抵抗氧化损伤，清除体内产生的自由基以及降低过氧化物的积累，而非通过增强其耐热力实现的。

表4 DELQ对线虫在氧化应激下的影响

图3 DELQ对线虫在氧化应激下的影响

机体寿命的延长在一定程度上是由于改善了细胞对胁迫条件的抵抗力，因而延缓衰老与压力应激条件下的存活率存在很大关系[23-24]。有研究表明，在胁迫条件下线虫的存活率越高，则其寿命延长效果越好[25]。Pietsch等[26]发现，槲皮素不仅可以延长线虫寿命，而且增加了线虫在热胁迫和氧化胁迫下的存活率。本研究结果证明DELQ能显著地增加线虫的压力应激和氧化应激能力，提高线虫的存活率，说明一定质量浓度的DLEQ对于线虫具有抗衰老的功效。

2.4超氧化物歧化酶、丙二醛及活性氧测定结果

在热应激和氧化应激存活率实验的基础上，又进一步对线虫体内的各项指标进行了测定。由表5可以看出，与空白无处理实验组比，空白热处理实验组和空白氧化处理实验组中丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）值均显著性增加，超氧化物歧化酶（SOD）显著减小（P＜0.05），这说明无论是热应激，还是氧化应激均能对线虫机体造成损伤。与此同时，还可以发现DELQ无处理组中SOD明显提升（P＜0.05），高扬等[19]在实验中也发现，在QEPV饲喂质量浓度为0.5 g/L和1 g/L时，果蝇的SOD值出现显著性增加。这很好的反映了DELQ等乳源性小肽对于线虫，并不仅仅是一种营养物质，还能有效提高机体的抗氧化能力，保护机体免受外界不良因子的刺激。

在35℃处理条件下，DELQ组与不加DELQ组相比仅MDA减小（P＜0.05），而ROS与SOD却无变化，这进一步佐证了DELQ并不能提高其在应激条件下的耐热能力。

在浓度为20 mmol/L的H2O2处理条件下，DELQ组中MDA和ROS值均明显低于不加DELQ组（P＜0.05），SOD也显著提高（P＜0.05），分析认为可能是DELQ在线虫体内能有效提高SOD含量，减少脂质过氧化物以及活性氧的产生，表现出良好的抗氧化、清除自由基功能。

SOD等诱导酶能及时清除自身过多的自由基，保持体内自由基的代谢平衡，是衡量机体健康状况的指标；MDA可以反映机体内脂质过氧化物反应程度，间接反映机体受损伤程度；活性氧簇ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的，能通过氧化应激反应导致细胞凋亡，因此，三个指标结合使用能很好地反映出机体的抗氧化能力以及受损伤程度。根据本实验的结果，DELQ能在一定程度上提高线虫体内的抗氧化酶系活性，并在氧化应激条件下，有效保护机体抵抗氧化损害，清除自由基，但并不能明显提高其耐热力。

表5 DELQ对线虫SOD、MDA及ROS的影响

3 结束语

本研究通过对线虫寿命、生殖能力、压力应激下的存活率以及各项抗氧化指标测定，研究了乳源性小肽DELQ所具有的抗氧化、清除自由基以及延缓衰老的功效及机理。研究结果表明，一定浓度的DELQ能明显提高线虫体内抗氧化物酶活力，减少过氧化物等有害物质的产生，有效延缓线虫衰老，同时并不会损害线虫的生殖能力。这进一步说明，DELQ是安全、无毒、具有良好的抗氧化活性。结果也证明了DELQ并不是通过增强线虫耐热力来延缓衰老。随着浓度的增加，线虫生殖能力却没有明显的提升，这可能原因是DELQ发挥作用的能力达到了其阈值，再增加效果不再明显，或是由于热量限制，导致线虫不再利用DELQ。然而，机体的衰老一个缓慢而复杂的生理学过程，而自由基清除学说只能解释其中一部分。因此，本研究为开展DELQ的抗衰老功效研究奠定了基础，其实际效果有待进一步深入采用高级动物实验来验证。

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Anti-aging efficacy of milk-derived peptide DELQ in caenorhabditis elegans

SHEN Peng1，CHENG Zhi-cai1，CHEN Jing1，LI Wan-ru1，ZHAN Dong-shen2，ZHANG Shao-hui1，3
（1.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2.Zhejiang Panda Dairy Pty.Ltd.，Wenzhou 325800，China；3.SJTU Bor S.Luh Food Safety Research Center，Shanghai 200240，China）

This research was based on the vitro study that milk-derived peptide DELQ showed good biological activities，c.elegans were used as experimental model to study the anti-aging efficacy of DELQ，which were treated with different concentrations of DELQ，tested by reproductive capacity assay to determine the effective dosage.The synchronized L4s were treated as control group and experimental group，in which the indexes of lifespan，fecundity，acute heat and oxidative stress were included，to explore the initial mechanism of anti-aging func⁃tion.As results showed，400 mg/L of DELQ was the best dosage for c.elegans to extend lifespan and enforce fecundity；DELQ had a signifi⁃cant effect on c.elegans’bodies in the level of SOD，MDA and ROS to protect against oxidant stress，but not did so in heat resistance.In conclusion，DELQ performed well in scavenging free radicals and enhancing oxidation resistance to help extend lifespan in some extent.

milk-derived peptide；the effective dosage；anti-aging；c.elegans

Q936

A

1001-2230（2016）09-0007-05

2016-04-09

沈鹏（1991-），男，硕士研究生，主要研究方向为乳制品生物活性。

张少辉