河北省冬枣黑斑病病原菌的分离鉴定及生物防治初探

宋 聪， 黄亚丽*， 谢晨星， 贾振华， 宋水山

(1.河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，河北 石家庄 050081；3.河北工业大学 化工学院，天津 300130)

河北省冬枣黑斑病病原菌的分离鉴定及生物防治初探

宋 聪1,2， 黄亚丽1,2*， 谢晨星1,3， 贾振华1,2， 宋水山1,2

(1.河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，河北 石家庄 050081；3.河北工业大学 化工学院，天津 300130)

冬枣黑斑病是冬枣重要病害之一，目前多以化学农药进行防治，给自然环境和人类健康带来了严重的威胁。河北省是冬枣种植大省，进行冬枣黑斑病病原菌的分离鉴定对冬枣黑斑病的有效防治具有重要意义。2014年8月至10月从河北省沧州、衡水、邯郸、邢台等地采集冬枣黑斑病病果，采用PDA培养基进行病原菌分离，从病样中共分离出2株分离频率较高的真菌，经过回接和再分离实验筛选出河北省冬枣黑斑病的致病菌株，经形态学和ITS序列分析初步确定该菌为细交链格孢(Alternariaalternata)。以枯草芽胞杆菌J18进行冬枣采后黑斑病的防治，浓度为1×108cfu/mL的菌液对病害的防效为80.67%。

冬枣；黑斑病；细交链格孢；鉴定；生物防治

冬枣是我国稀有的优质晚熟鲜食枣果品种，其营养丰富、品质优良，倍受消费者青睐。冬枣市场供不应求，种植效益十分可观，促使冬枣栽培面积迅速扩大、产量逐年递增，成为我国河北、山东、新疆等地农业经济又一重要支柱。随着冬枣种植业的发展，冬枣病害也普遍发生。黑斑病是一种危害非常严重的冬枣病害，使枣果产量、品质下降，不能贮存，严重影响了枣果的商品性，多数发病枣园的直接经济损失在20%以上，严重制约了冬枣产业的健康发展[1]。探明冬枣黑斑病的病原菌，是冬枣果实黑斑病有效控制和生物防治的前提。随着冬枣黑斑病的蔓延，对不同地区冬枣黑斑病病原菌进行分离鉴定的相关研究逐渐增多，然而相关的研究结果存在很大的差异[2-4]。河北省是我国冬枣的重要产区，明确黑斑病病原菌对河北冬枣产业的健康发展和有效防治具有重要意义。本研究从河北省不同冬枣产区进行黑斑病病果的采集和病原菌分离，并以本实验室分离保存的拮抗菌株枯草芽胞杆菌J18[5]对冬枣采后黑斑病进行防治，旨在为冬枣采后黑斑病的有效防治提供理论依据和菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 2013年8月5日至10月10日在冬枣黑斑病的主要发病期内，于河北省沧州、衡水、邯郸、邢台4个地区的冬枣果园采集冬枣黑斑病病果。

1.1.2 培养基 冬枣黑斑病病原菌分离培养基为PDA培养基(含有浓度为300 μg/mL的庆大霉素)。

1.1.3 生防菌株 枯草芽胞杆菌J18 (BacillussubtilisJ18)，由本实验室分离鉴定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离 将冬枣病果用75%的酒精表面消毒30 s后，灭菌水冲洗3次，用灭菌手术刀从病健交界处切取2～3 mm的组织块，取病斑5块置于PDA培养基中，28 ℃培养5 d，观察记录分离菌的菌落形态、种类和数量，统计各种菌的分离频率即各菌的个数占所有菌数的百分比。将分离获得的菌落划线纯化后编号，接种到PDA试管斜面培养基4 ℃冰箱保存。

1.2.2 分离物的致病性测定 挑取分离真菌菌块接种到PDA培养基上，28 ℃培养7 d，用含有0.05%Tween-80的无菌水冲洗菌落表面，3层纱布过滤后收集孢子悬液，并将孢子浓度调整为1×105cfu/mL备用。病原菌接种方式分为刺伤接种和无伤接种。刺伤接种方法：挑选健康的冬枣果实30个，75%酒精消毒30 s，无菌水洗涤3次，用直径5 mm的打孔器在果腰部位打孔，孔内接种10 μL孢子悬液；无伤接种方法：采用喷壶将病原菌孢子液直接喷洒到经酒精和无菌水清洗过的冬枣果实上，以冬枣表面均匀覆盖液滴为标准。处理后的果实分别装入塑料袋中，置于25 ℃培养箱中，每天观察果实的发病症状，统计7 d后致病率。对发病果实进行再分离，观察菌落及孢子形态是否与所接种真菌相同。

1.2.3 冬枣黑斑病病原菌的形态学特征 将筛选所得的病原菌接种到PDA培养基上进行活化，28 ℃培养3 d后，在菌落边缘打取直径5 mm的菌块转接到PDA培养基的中央，每天定时观察记录菌落形态及测定菌落直径。菌落产孢后，挑取少量菌丝用光学显微镜观察菌丝和孢子形态。

1.2.4 冬枣黑斑病病原菌的IST序列扩增及系统发育树构建 将供试菌株转接到PDA平板上活化培养5 d，用灭菌水冲洗菌落表面并收集孢子液。吸取1 mL 孢子液接种到50 mL PDA液体培养基中，28 ℃、150 r/min 培养 3 d，过滤收集菌丝，采用北京天根生物科技有限公司的真菌DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取。以病原真菌DNA 为模板，以ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3′和 ITS4：5′-GCATATCAATAAGCGGAGG-A-3′为引物，进行PCR扩增。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR扩增片段送上海生物工程有限公司测序，采用 MEGA 4.0 软件进行系统发育树构建。

1.2.5 生防菌株J18对冬枣黑斑病的抑菌效果 在PDA平板中央接种直径为5 mm 的病原真菌(2-6a)的菌块，在距平板中央 3 cm 处均匀接种4处J18菌，28 ℃培养 5 d 后，测量抑菌带宽度。

1.2.6 生防菌株J18对冬枣采后黑斑病的防治效果 用直径5 mm的打孔器在冬枣健康果实的中部打孔，分别在果实伤口处接种浓度为1×108、1×107、1×106cfu/mL的J18菌悬液10 μL，以无菌水为对照，2 h后再加入10 μL浓度为1×105cfu/mL的病原菌孢子悬浮液。将果实放入400 mm×700 mm×280 mm塑料筐内，筐口封保鲜膜保湿，25 ℃恒温放置。7 d后测定果实的发病率和病斑直径，每处理30个果实，3次重复，试验重复2次。

2 结果与分析

2.1 冬枣黑斑病病果中真菌的分离

从河北省沧州、衡水、邯郸、邢台四个地区共采集黑斑病病枣260个，从病健交界部位进行病原菌分离，得到2株分离频率较高的真菌(表1)，分别命名为2-3a、2-6a，其中2-6a分离频率最高，四个地区均在65%以上，以沧州地区最高，达到91.5%。

表1 冬枣黑斑病病果中分离的真菌 及各种真菌的分离频率Table 1 The fungi and ration screened from Dongzao Fruit with black spot disease

2.2 分离真菌的致病性测定

采用刺伤和无伤接种两种方法进行分离真菌的回接。刺伤回接试验结果表明，菌株2-6a回接到冬枣果实上3 d后出现病斑，病斑直径约5～10 mm，圆形或半圆形，病部色泽为灰褐色，病斑下为软烂组织，发病症状与自然情况下黑斑病症状相似；接种7 d时，致病率为75.6%。无伤接种2-6a，发病慢且轻，接种7 d后冬枣黑斑病致病率为40%。对出现典型症状的果实再次分离病原菌，分离到的真菌与2-6a菌落形态相同，再分离频率在80%以上。刺伤和无伤接种2-3a在冬枣上均不能引起黑斑病发生(表2)。

表2 冬枣黑斑病分离物回接健康 果实的致病率Table 2 The pathogenicity rate of fungi screened from Dongzao Fruit with black spot disease

2.3 冬枣黑斑病病原真菌的鉴定

2.3.1 病原菌形态特征 菌株2-6a接种到PDA培养基上，首先长出白色绒状菌丝，随着菌落的扩展，菌落中央成为墨绿色，外缘白色，平均生长速度为1.02 cm/d。(图1A)。显微镜观察发现菌丝有隔，分生孢子为纺锤状、深褐色、中间有隔、顶部有鸟嘴状突起(图1B)。

图1 菌株2-6a的菌落及分生孢子显微照片Fig.1 The photo of 2-6a colony and conidiosporeA：菌落照片；B：400倍显微镜照片A：GOLONG;B:400×Photomicrograph

图2 菌株2-6a系统发育树Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences of strain 2-6a

2.3.2 2-6a的分子生物学鉴定 以2-6a基因组DNA为模板，利用引物ITS1/ITS4 扩增出长度约650 bp的条带，经测序并在GenBank中BLAST比对，证实该PCR产物为真菌核糖体 ITS 特异片段，与链格孢霉属(Alternariasp.)的亲缘关系较近，同源性达到 99%以上。系统发育树分析显示，该菌与细交链格孢(Alternariaalternata)、细极链格孢(Alternariatenuis)聚合于同一分支，结合形态学特征[6]鉴定该菌为细交链格孢(Alternariaalternata)，见图2。

2.4 枯草芽胞杆菌J18对冬枣黑斑病菌的抑制作用及其对采后黑斑病的防效

2.4.1 枯草芽胞杆菌J18对冬枣黑斑病菌的抑制作用 J18是本实验室分离保存的一株具有拮抗作用的枯草芽胞杆菌，该菌对梨黑斑病及采后病害具有良好的防效[5]。对冬枣黑斑病的拮抗试验表明(图3)，J18也能够显著抑制冬枣黑斑病菌的生长，抑菌带宽度为11.2 mm。

图3 J18对冬枣黑斑病菌的拮抗作用Fig.3 The antagonistic on Dongzao Fruit black spot disease by J18A：对照平板;B:J18与黑斑病病原菌的拮抗平板A：CK；B：J18 antagonist with black spot disease on plate

2.4.2 J18对冬枣采后黑斑病的防治效果 与对照相比，3种浓度的拮抗菌J18均能降低冬枣黑斑病的致病率，控制病斑直径的扩展，所有J18喷施处理的冬枣发病率和病斑直径均与清水对照存在显著差异(P≤0.05)。分析各处理冬枣黑斑病致病率发现，J18菌液浓度与冬枣致病率呈反比，菌液浓度越高，其致病率越低，其中浓度为1×108cfu/mL的处理防病效果最好，为80.67%，病斑直径比对照小8.41 mm,见表3。

表3 不同浓度J18菌液对冬枣采后 黑斑病的抑制作用Table 3 The control efficiency on postharvest Dongzao Fruit black spot disease by J18 at

注：单因素方差分析，P≤0.05，不同字母表示差异显著

3 讨 论

对从河北省沧州、衡水、邯郸、邢台四个地区采集的冬枣黑斑病果实进行分离，得到2株分离频率较高的菌株，其中菌株2-6a分离频率最高，四个地区均在65%以上，其中沧州地区最高为91.5%。回接健康冬枣果实发现，真菌2-6a的刺伤接种致病率为75.6%，无伤接种的致病率为40%；而真菌2-3a则不能引起冬枣果实黑斑病的发生，初步确定2-6a是冬枣黑斑病的病原菌，而2-3a可能是一种冬枣黑斑病腐生真菌。通过形态学和ITS序列分析进行2-6a的分类鉴定，确定该菌为细交链格孢(Alternariaalternata)。吴玉柱等[2]对山东冬枣黑斑病的病原菌进行分离鉴定，证实细极链格孢(Alternariatenuissima)为山东冬枣黑斑病的主要病原菌；王军等[3]通过回接健康果实,确定了导致山东沾化县和东营市河口区冬枣黑斑病的致病菌为细交链格孢菌(Alternariaalternata)；宗淑萍等[4]则确定桑壳小圆孢菌(Coniothyriumfucsidulum)、仁果 茎 点 霉(Phomapomirum)以 及 细 交 链 格 孢(Alternariaalternata)是冬枣黑斑病的病原菌，其中细交链格孢只参与混合侵染，在单独侵染时不具备治病能力。目前，对引起冬枣黑斑病的病原菌还没有统一的结论，因此潜在的危害性巨大。明确不同地区冬枣黑斑病病原菌的种类，对该病的有效防治具有重要意义。

冬枣黑斑病不仅危害生长期的冬枣果实，对冬枣采后贮藏品质影响更大，冬枣黑斑病菌侵染的果实在常温下放置 10 d，腐烂率高达80%，低温贮藏 60 d 左右，果实腐烂严重，采取安全有效的冬枣黑斑病防治方法成为当务之急。生物防治是目前水果采后病害防治的研究热点，然而冬枣采后病害生物防治的研究相对较少，目前在国内仅有从冬枣果实表面1株酵母菌[7]、1株成团泛菌[8]以及从土壤中筛选出1株枯草芽胞杆菌[9]进行冬枣采后黑斑病防治的报道，本研究利用具有优良拮抗作用的J18菌株进行冬枣黑斑病的防治，在浓度为1×108cfu/mL的情况下病害防效达到80.67%。该拮抗菌株能否跟其他的果疏贮藏保鲜措施相结合，及其拮抗原理尚需进一步研究。

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[2] 吴玉柱, 季延平, 刘会香, 等. 冬枣黑斑病病原菌的鉴定[J]. 中国森林病虫, 2005, 24(2): 1-3.

[3] 王军, 辛玉成. 冬枣黑斑病病原的分离与鉴定[J]. 青岛农业大学学报, 2007, 24(1): 21-23.

[4] 宗淑萍, 杨文香, 刘大群, 等. 冬枣黑点病病原鉴定[J]. 华北农学报, 2006, 21(5): 105-107.

[5] 宋聪, 宋水山, 关军锋, 等. 梨采后黑斑病拮抗菌J18的鉴定及防治效果的初步研究[J]. 现代食品科技, 2011, 27(1): 6-10.

[6] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社, 1979.

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[8] 薛梦林, 张力群, 张继澍, 等. 拮抗菌B501的鉴定及其对采后冬枣黑斑病的抑制效果[J]. 中国生物防治， 2008, 24(2): 122-127.

[9] 耿海峰，张丽珍，牛伟，等. 冬枣采后病害拮抗菌的筛选和鉴定[J]. 食品科学，2010, 31(9): 150-156.

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Black Spot Disease in Dongzao Fruits and Study on the Biocontrol

SONG Cong1,2, HUANG Ya-li1,2, XIE Chen-xing1,3, JIA Zhen-hua1,2, SONG Shui-shan1,2

(1.Inst.ofBiol.,HebeiProv.Acad.,Shijiazhuang050081; 2.HebeiProv.MicrobialControlEngin.Tech.Res.Ctr.forMainCropDis.,Shijiazhuang050081; 3.Coll.ofChem.Engin.,HebeiEngin.Uni. ，Tianjin300130)

Winter jujube of Dongzao (Zizyphus jujuba Mill cv. Dongzao) black spot disease is one of important diseases, at present it is control mainly by chemical pesticide which causes serious threat of natural environment and human health. Hebei province is major province in Dongzao cultivation, therefore, the isolation and characterization of pathogens of Dongzao black spot disease possesses important significance for controlling the disease. Samples of sick fruit with black spot disease were collected from August to October in 2014 in Cangzhou, Hengshui, Handan, and Xingtai and other areas of Hebei Province, two fungal strains with high isolation rate were isolated from the samples. Back inoculation and re-isolation experiment had screened the pathogen that caused Dongzao black spot disease in Hebei Province. The pathogen was identified initially asAlternariaalternatabased on the morphology and ITS sequencing analysis of the fungus.BacillussubtilisJ18 was taken to carry out the control the postharvest black spot disease of Dongzao fruit. The controlling efficiency was 80.67% with 1×108cfu/mL bacterial suspension.

Dongzao (Zizyphus jujuba Mill cv. Dongzao); black spot disease;Alternariaalternate; identification; biocontrol

河北省科技计划项目(14226501D)；河北省科技条件建设项目(15963203D)

宋聪 女，硕士。主要从事植物病害的生物防治研究。Tel：0311-83014618，E-mail：songcong1982@126.com

*通讯作者。女，博士，研究员，硕士生导师。研究方向为植物病害的生物防治。Tel: 0311-83014618，E-mail：huangyali2291@163.com

2015-10-14；

2016-01-27

Q78

A

1005-7021(2016)05-0085-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.015