基于微流控技术的微生物细胞梯度稀释分离方法

徐 娟， 蓝 英， 潘迎捷,2,3， 赵 勇,2,3， 张炜佳,2,3*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

基于微流控技术的微生物细胞梯度稀释分离方法

徐 娟1， 蓝 英1， 潘迎捷1,2,3， 赵 勇1,2,3， 张炜佳1,2,3*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

随着微流控分析技术的快速发展，集成化的微流控芯片在满足实验高通量的同时，还在微生物细胞分离领域呈现出独特的优势。本研究基于微流控技术，制备了以聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻片为材料的细菌细胞梯度稀释分离芯片。该芯片的核心是通过一系列复杂的梯度网络来实现对细菌悬液的连续稀释，最终被分离的细菌细胞进入通道末端的存储孔内。结果显示，该方法能分离出的最少细菌细胞数低于10个。此芯片平台操作简单、耗时短、成本低，为微生物单细胞研究提供了新的途径。

微流控芯片；微生物细胞分离；连续梯度稀释

传统微生物研究常以微生物群为分析对象，其所得到的群体平均信息往往掩盖了微生物细胞之间的差异，导致实验结果的偏差[1]。微生物单细胞分析(single-cell analysis)突破了以往诊断技术的瓶颈，可以研究微生物群中单个细胞独特的功能和状态，深入解析微生物细胞间的异质性、相互作用、信号传导以及生理病理等运作机制[2]。从单个细胞入手阐明细菌的生长动态[3-5]、耐药性[6-8]、趋化性[9]、运动行为[10]、群感效应[11]、被膜形成[12]以及进化[13]等生命活动的规律，成为现阶段研究的热点之一。以微机电加工发展起来的微流控技术，因集成度高、微型化、高通量等优势在微生物细胞分离研究领域显示出极大的应用潜力[14]。目前，微流体细胞分离设备主要分为液滴式微流控和芯片式微流控两大类。这两种装置有很大差异，但它们的共性是将微生物细胞分离到微升(μL)或纳升(nL)级的反应室中，以此实现微生物细胞分离，同时降低实验成本[15]。芯片式微流控具有与微生物细胞大小相匹配的通道尺寸(1～100 μm)，通过灵活的结构设计和精确的流路控制，在微生物细胞的定向操纵和微环境调控中呈现出独特的优势[16]。Probst等[17]利用流体力学原理，在芯片入口注入气泡，使通道中液流流经气泡时由原本的层流状态变为对流。借助液流流向改变，成功将谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)截留在皮升级的微孔中，达到单个细菌接种的目的。通过凝胶包埋的方式，Choi等[18]将金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和肠球菌(Enterococci)固定在芯片琼脂糖通道内，实现了细菌单细胞生长的实时观察和药敏检测。液滴式微流控由传统的单相微流控芯片技术发展而来，可以将微生物细胞封装入液滴而不受外界条件的干扰，是良好的单细胞分离及反应设备[19-20]。Leung等[21]设计了一种编程式液滴芯片，该芯片由底部的蠕动泵和顶部的阵列液滴反应孔组成，每个微液滴包裹一个细菌细胞，单次实验即可进行大规模细菌单细胞的培养。以上实验多需要微通道内的流体模拟、灌注凝胶和制备液滴等，与之相比，微流控浓度梯度芯片可以利用多层次的分流汇流将样品溶液快速稀释，具有操作简单、方便快捷等特点，为微生物细胞分离提供了新的方法[22]。徐艇[23]发明了一种微流控型人源细胞分离器，该装置主要包括底座、斜面活动盘以及树状微流道。细胞悬浮液在斜面活动盘的树状微流道及重力作用下，实现分流分离。本研究根据上述连续梯度稀释网络的芯片设计及其在细胞分离研究中的应用，制备了一种针对细菌细胞分离的圣诞树型微流控芯片，实现了细菌单细胞水平的分离。该芯片的核心是借助一系列复杂的梯度网络来实现对细菌悬液的连续稀释。此外，以更小尺寸的连接通道将主稀释通道和细菌存储孔相连的构型及入口角度的设计，使少量细菌细胞随液流方向改变进入存储孔中。实验结果表明，该芯片性能良好，可对106数量的细菌细胞有效分流分离，为所需微生物细胞数目小或需从大量微生物细胞中分离出少量细胞的分析研究提供了新的角度，也拓展了微流控浓度梯度芯片在微生物细胞分离领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血性弧菌标准菌株VibrioparahaemolyticusATCC33847购自美国菌种保藏中心，于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 材料与试剂 多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)购自上海生工生物工程有限公司；SU-8胶(SU-8 2025,美国MicroChem公司)、Sylgard 184硅橡胶弹性体和Sylgard 184固化剂(美国 Dow Corning公司)、单晶硅片(4英寸)购自上海蒙昌仪器有限公司。

1.1.3 主要仪器 URE-2000/35型光刻机(中科院光电技术研究所)；2XZ-2型真空泵(上海酷瑞泵阀制造有限公司)；BPZ-6063LC型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KW-4A型台式匀胶机、BP-2B型烘胶、WH-1000等离子表面处理机、LSP01-1A型微量注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)；Eppendorf 离心机( 5810R，美国 Eppendorf 公司)；Bio-Tek 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；EVOS®FL Auto全自动细胞成像系统(美国Life Technologies公司)； 美国 Milli-Q去离子水仪。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离芯片的设计和制作 选用经典的“圣诞树”型梯度稀释微流控芯片分离细菌单细胞[24]。如图1所示，芯片流体层结构主要由9级梯度形成网络(Concentration Gradient Generator，CGG)和20个细菌存储孔组成。流体层通道高20 μm，宽50 μm，梯度网络的每个蛇形通道单元长5.776 mm，细菌存储孔的截面为直径96 μm的圆形结构。为减少流体通道中液流剪切力对存储孔中细菌的损伤，并使细菌能够固定在存储孔中稳定生长，存储孔排列在流体通道的一侧。存储孔以尺寸更小的连接通道(上端23 μm，下端15 μm)与蛇形通道下端的垂直通道相连。连接通道入口设定一定角度，使少量细菌细胞随液流方向改变进入存储孔中。芯片采用标准软光刻技术(soft-lithography)及模塑法制作[25]。

图1 细菌细胞分离芯片设计图Fig.1 Design of the bacteria cell separation chipA：梯度网络蛇形通道的放大结构；b：细菌细胞存储孔的放大结构A：Magnification of the serpentine channel of the gradient generator；b：Magnification of the bacteria cell storage well

1.2.2 细菌分离芯片的处理 将制备好的芯片于1×105Pa灭菌15 min，65 ℃烘干。使用前向芯片内灌注10 μg/mL的多聚赖氨酸溶液(Poly-L-lysine, PLL)对芯片进行包被，连续通入30 min后，将芯片放入培养皿内待用[26]。

1.2.3 芯片上的细菌细胞分离 取对数期生长的副溶血性弧菌(OD600=0.6)于10 mL离心管中，离心10 min (3 000 r/min，25 ℃)，去上清，加入新鲜培养液，调整菌悬液的浓度使其终浓度为5×106cfu/mL。把细菌悬液和新鲜培养液分别加入1 mL注射器内，将注射器固定在注射泵上，以聚四氟乙烯管与芯片上相应入口相连。设置进样速率为0.1 μL/min，进样1 h。改变进样速率，以低于接种速率10倍的流速在2个入口通入新鲜培养液，冲走通道中未黏附的细菌。其后，利用EVOS®FL Auto 显微镜的全自动成像系统，对细菌细胞分离结果进行观察及拍摄。

2 结果与分析

2.1 细菌分离芯片的制作与表面处理

本研究制备的双层结构细菌分离芯片由上层带有流体通道的PDMS和下层适合细菌贴壁的玻片键合而成(图2)。PDMS作为微流控技术中理想的使用材料之一，具有很多良好的特性，如热稳定性高、生物兼容性强、透气透光性好，易于在显微镜下观察等。尽管PDMS有诸多优点，但未经处理的芯片还不能直接用于细菌细胞的培养。实验前应用75%的酒精多次冲洗芯片通道，以清除芯片加工过程中残留的灰尘粒子等杂质；对芯片进行高压灭菌处理，可保证芯片内没有其他杂菌的污染。由于PDMS具有较强的疏水性，在向通道内输送培养液时容易产生气泡，对细菌造成损伤。为此，需采用合适的包被试剂，如明胶、 多聚赖氨酸、 纤连蛋白和胶原等使PDMS表面的亲水性增加，以保持液体在通道内流动的顺畅[27]。

图2 细菌细胞分离芯片Fig.2 The photograph of bacteria cell separation chip

2.2 梯度稀释网络形成能力的验证

在连续稀释过程中，混合误差由上一级到下一级逐级累加，因此充分混合是形成稳定浓度梯度的前提条件。液体在微通道内的流动阻力是影响混合效果的主要因素。当所有微通道截面形状相同时，流阻便取决于蛇形管道的总长度L。而增加2种溶液之间的接触面可以提高分子扩散，因此通道长度越长，分子扩散越充分，混合效果越佳。此外，溶液流速小更利于混合[28]。根据以上理论分析，在本实验中梯度网络蛇形通道长度一定的情况下，则可通过调节进样流速来控制浓度梯度的形成。

图3a为用红蓝指示剂对芯片梯度网络进行的定性表征。芯片的2个入口分别注入红色指示剂和蓝色指示剂，控制溶液流速为0.1 μL/min。在流体剪切力的作用和扩散效应下，2种溶液在蛇形通道内逐级分配、混合，最终在芯片末端的垂直通道各自形成不同的颜色。采用Color Cop软件拾取每行的颜色，拾取颜色的顺序为从左到右，记录每行中颜色的RGB值，选取红色分量(Red value)进行定量分析。从图3b每行的线性梯度曲线可知，红蓝指示剂从梯度网络的上一级到下一级均充分混合，最终可产生10个具有一定线性的不同浓度，直观地表明该芯片能用于后续的细菌细胞分离实验。

图3 芯片梯度网络形成能力的验证Fig.3 Validation of the gradient networkA：梯度网络的红蓝指示剂表征;b:以红色分量值为指标的行2～行9的浓度梯度曲线A：Representation of the gradient network with red and blue dye;b:Concentration gradient curve based on red and blue value from line 2 to line 9

2.3 基于芯片的细菌细胞分离原理

该芯片平台基于连续稀释原理，即通过一系列连续简单的稀释以减少细菌浓度，使菌液在多层次通道网络作用下实现分流分离。如图4所示，芯片的2个入口同时通入新鲜培养液和细菌悬液，两者在梯度网络中逐级分流、汇流混合，如此循环反复，最终细菌细胞进入到皮升(pL)级的存储孔中。此外，以更小尺寸的连接通道将主稀释通道和细菌存储孔相连的构型及入口角度的设计，使少量细菌细胞随液流方向改变进入存储孔中，以此达到分离的目的。

图4 细菌细胞分离芯片Fig.4 The bacteria cell separation chip

a:细菌细胞分离芯片，结构a1、a2分别对应图b、图c;b:芯片2个入口同时通入培养液和细菌悬液，在连续稀释的作用下形成图c所示的细菌细胞分离效果

a：Schematic drawing of the chip channel geometry；b：Medium and bacteria cells were loaded from the two inlets，With the performance of gradient network, bacteria cells were separated by continuous dilution which showed in c

2.4 芯片上的细菌细胞分离

芯片通道内空间狭窄，细菌接种前应将菌液充分振荡，以免细菌细胞成团堵塞通道或在芯片内分布不均。选择低进样流速，易于细菌细胞在存储孔内停留并贴壁。由图5可见，细菌细胞在芯片内部均匀铺展，少有抱团。孔1～孔5中，细菌细胞以随机分布的形式在存储孔中单层呈现。由于通道的高(20 μm)与细菌细胞的大小(2～3 μm)不在同一尺度，当孔内细菌细胞逐渐增多时，细菌细胞在有限的存储空间会出现上下重叠的现象。故选取孔1～孔8作为分析对象。如图6所示，该芯片平台能够分离出的最少细菌细胞数低于10个，成功实现了细菌细胞的分流分离。然而，该方法仅是依赖于通道结构的简单分离，只针对某一类微生物细胞，不能对大小形状相似的不同种细胞进行精确分离。因此，采用更精密的加工技术，优化通道设计是下一步的研究方向。

图5 细菌细胞分离结果显微观察图Fig.5 Phase contrast fields at 40× magnification of bacteria cell well

图6 8个存储孔内细菌细胞数分析Fig.6 Bacterial cell number analysis in eight storage wells

3 讨 论

基于微流控芯片技术，本研究设计并制作了一种微生物细胞分离芯片。该芯片借助一系列梯度网络实现对细菌悬液的连续稀释，可对106数量的细菌进行有效分离，且能分离出的最少细菌细胞数低于10个。该方法操作简单、分离时间短、节约试剂、避开了荧光标记和复杂精细的检测系统，为微生物单细胞研究提供了新的技术手段。此外，该芯片平台还可以用来进一步探索微生物单细胞水平上的生长行为、运动特性以及药物刺激等研究，具有一定的应用前景。

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A Microfluidic Gradient-Dilution Chip for Rapid Microbe Cell Separation

XU Juan1, LAN Ying1, PAN Ying-jie1, 2, 3, ZHAO Yong1, 2, 3, ZHANG Wei-jia1, 2, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306; 2.ShanghaiEngin.Res.Ctr.ofAqua-Prod.Process. &Preserv'n,Shanghai201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm'tforAqua-Prod.onStor. &Preserv'n(Shanghai),Minist.ofAgric.Shanghai201306)

Along with the rapid advances in microfluidic technology, the integrated microfluidic chip has the potential to meet the demand of high-throughput experimentations in lab and especially presents the special superiority in the field of microbe cells separation. Based on the microfluidic technology, a polydimethoxysilane (PDMS)-glass microchip was prepared in this study which contains a network of gradient-forming channels for bacteria cells separation. The core of the microchip is to realize a successive dilution process by means of a series of complicated gradient network and finally the isolated bacteria cells entered to the end of the channel. The results showed that the number of separated bacteria cells by this method could be separated at minimum of less than ten. This chip platform is simple to operate, short time consuming, and low cost, which provide a new pathway to study microbe single-cell.

microfluidic chip; microbe cells separation; successive gradient dilution

国家自然科学基金项目(31501555)；上海市科委项目(14DZ1205100,14320502100)；浦江人才计划项目(14PJ1404300)；

徐娟 女，硕士研究生。研究方向为微流控微生物分析芯片。E-mail: yuansuwawaxj@163.com

* 通讯作者。男，教授，博士。研究方向为微流控生物化学分析芯片。E-mail: wj-zhang@shou.edu.cn

2015-11-25；

2015-12-04

Q-31

B

1005-7021(2016)05-0097-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.017

上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字2015第4-8号)